杜逸
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 供职机构：中国医科大学药学院药物毒理学教研室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 钙调蛋白N_2和C_2突变体载体的构建、表达纯化和鉴定被引量：1
- 2017年
- 目的构建钙调蛋白(CaM)N_2和C_2突变体的表达性载体,表达纯化并进行活性鉴定,为进一步研究CaM与钙通道片段的相互作用奠定基础。方法将CaM的N-lobe和C-lobe的cDNA分别与相应的N-lobe和C-lobe的cDNA相连,制备N_2和C_2突变体的cDNA。将N_2和C_2的cDNA分别插入p GEX-6p-3载体,并将重组质粒转入E.coli BL21菌株,IPTG诱导转化成功的菌株表达GST融合蛋白,超声破碎法提取,GS-4B beads纯化,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白相对分子质量及纯度,pull-down实验鉴定活性。结果酶切鉴定以及DNA测序结果证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE电泳图显示突变体蛋白纯度和浓度均较高;pulldown实验结果证明突变体蛋白有生理活性,能与钙通道片段结合。结论本研究成功构建了N_2和C_2表达质粒,并提取、纯化了有活性的钙调蛋白N_2和C_2突变体。
- 晏珊雷帅陈思充于佳慧祝旭东孙嘉瑶杜逸李墨唐子鉴郝丽英
- 关键词：钙调蛋白N2C2
- 钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备
- 2016年
- 目的构建钙调蛋白(Ca M)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,Clobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述c DNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav1.2型钙通道结合并可恢复已"rundown"心肌细胞膜钙通道的活性。结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究Ca M的生物学功能奠定了基础。
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- 关键词：钙调蛋白突变体膜片钳
