黄荣
- 作品数：7 被引量：6H指数：1
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- 致病性大肠埃希菌EspA抗血清制备及其对细菌粘附的影响
- 2016年
- 目的制备致病性大肠埃希菌(EPEC)分泌蛋白A(EspA)抗血清,并检测其对EPEC粘附的中和作用。方法以EPEC标准株E2348/69为模板,采用PCR方法获得EspA基因,将目的基因连接载体pET32a,构建重组表达质粒pET32a-EspA,转入表达菌株BL21后用IPTG诱导表达并采用Ni-柱亲和层析法纯化EspA;以纯化EspA辅以佐剂免疫家兔,多次免疫获得抗血清,采用中和试验检测抗血清中和EPEC粘附Hep-2细胞的能力。结果成功构建EspA原核表达质粒,表达蛋白分子质量单位为37ku,与预期值相符。用纯化的表达蛋白EspA免疫家兔,对流免疫电泳检测抗血清的效价为1∶2,但稀释度≤1∶16时仍能效抑制EPEC粘附Hep-2细胞。结论 EspA抗血清具有抑制EPEC粘附Hep-2细胞作用,有望为疫苗研发的候选抗原。
- 郭永明黄荣王朝莉杨晓红杨健
- 关键词：致病性大肠埃希菌抗血清粘附
- 乙型脑炎病毒疫苗株包膜蛋白K138E回复突变对其神经毒力的影响被引量：1
- 2019年
- 目的探索乙型脑炎疫苗株包膜蛋白(E蛋白)138位氨基酸向野毒株回复突变对其神经毒力与神经侵袭力的影响。 方法采用重叠延伸PCR技术扩增含有K138E突变位点的DNA片段,构建乙脑疫苗株E蛋白K138E位氨基酸突变的病毒感染性克隆,体外转录病毒RNA,电转染BHK21细胞拯救病毒,绘制病毒生长曲线,采用蚀斑试验与测序鉴定突变病毒,通过动物试验评价突变病毒与疫苗株对昆明小鼠的神经毒力和神经侵袭力。 结果酶切和测序表明K138E突变病毒感染性克隆构建成功,并通过电转染BHK21细胞包装得到K138E突变病毒。蚀斑试验显示突变病毒的蚀斑稍大于疫苗株,两株病毒的生长曲线与神经侵袭力无明显不同,但突变病毒神经毒力显著升高。 结论乙脑疫苗株E138位氨基酸回复突变后神经毒力增强,E138位氨基酸是调控疫苗株神经毒力的重要位点。
- 袁磊唐丽萍黄荣冯亚岚杨会强杨健李玉华
- 关键词：乙型脑炎回复突变神经毒力感染性克隆
- 乙脑/寨卡嵌合病毒包膜蛋白T120A位点突变对小鼠脑内神经毒力的影响被引量：1
- 2021年
- 为探索包膜蛋白T120A突变对乙脑/寨卡嵌合病毒JEV/ZIKV小鼠脑内神经毒力的影响,应用重叠延伸PCR和分子克隆技术构建含T120A突变的乙脑/寨卡嵌合病毒全长cDNA质粒,经酶切、测序鉴定后,以其为模板体外转录制备RNA,电转染导入BHK21细胞,收获培养液上清获得突变病毒株JEV/ZIKV(T120A)。分别用JEV/ZIKV和JEV/ZIKV(T120A)感染BHK21细胞,绘制病毒增殖曲线,比较蚀斑大小;脑内接种昆明鼠,比较病毒小鼠脑内神经毒力差异。突变病毒感染性克隆经酶切鉴定表明成功构建,增殖曲线发现:突变病毒高峰滴度为5.59 log10pfu/mL,低于JEV/ZIKV的峰值(6.8 log10pfu/mL),JEV/ZIKV(T120A)的小鼠脑内神经毒力LD50为1.38 PFU(0.03 mL),JEV/ZIKV病毒LD50为2.21 PFU(0.03 mL)。研究表明寨卡病毒包膜蛋白T120A突变降低了乙脑/寨卡嵌合病毒的复制能力,但却轻微增强了病毒小鼠脑内神经毒力。
- 冯亚岚李玥珂任阳唐丽萍黄荣袁磊杨健
- 关键词：乙脑病毒嵌合病毒包膜蛋白神经毒力
- 乙型脑炎病毒野毒株SA14包膜蛋白K279M突变对其神经毒力的影响被引量：3
- 2019年
- 目的构建乙型脑炎病毒野毒株SA14包膜蛋白K279M突变株感染性克隆并拯救病毒,探索K279M突变对其毒力的影响。方法应用重叠延伸PCR和分子克隆技术构建含有K279M突变的乙脑突变病毒全长cDNA质粒,经酶切鉴定后,以其为模板体外转录获得RNA,电转染BHK21细胞,得到恢复病毒JEV SA14(K279M)。分别用野毒株JEV SA14和JEV SA14(K279M)接种BHK21细胞和脑内接种昆明鼠,比较突变株与野毒株的蚀斑大小、生长特点以及对昆明鼠的神经毒力。结果酶切鉴定表明,突变病毒感染性克隆成功构建。病毒蚀斑试验显示,JEV SA14(K279M)的蚀斑直径约为2~3 mm,大于野毒株蚀斑直径的1~2 mm。突变株病毒LD50为0.21PFU,大于野毒株病毒LD50的0.05PFU。结论乙脑包膜蛋白K279M突变增大了病毒的蚀斑,但降低了病毒的脑内神经毒力。
- 冯亚岚刘超越李玥珂黄荣袁磊唐丽萍杨健
- 关键词：乙脑病毒正向突变神经毒力
- 寨卡病毒包膜蛋白D393E突变对乙脑/寨卡嵌合病毒小鼠脑内神经毒力的影响被引量：1
- 2020年
- 目的构造乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)/寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)嵌合株JEV/ZIKV包膜蛋白D393E突变的病毒感染性克隆并进行突变株的拯救,探讨D393E突变对病毒小鼠脑内神经毒力的影响情况。方法利用分子克隆和重叠延伸PCR技术构造含D393E突变的嵌合病毒质粒,并用线性化处理后的质粒片段进行转录,取得病毒RNA,电转染入细胞,获得突变株。用突变病毒、源病毒分别感染细胞和小鼠,对比两种病毒的复制效率、蚀斑特点以及脑内神经毒力差异。结果酶切结果证实:突变株JEV/ZIKV(D393E)感染性克隆成功地构建。病毒蚀斑实验:JEV/ZIKV(D393E)的蚀斑直径为0.7±0.2 mm,JEV/ZIKV蚀斑直径为1.3±0.2 mm。病毒小鼠脑内毒力检测:JEV/ZIKV(D393E)的LD50为31.51PFU,JEV/ZIKV的LD50为2.21PFU。结论ZIKV D393E突变使嵌合病毒对小鼠的脑内神经毒力减弱。
- 冯亚岚李玥珂任阳黄荣袁磊唐丽萍杨健
- 关键词：嵌合病毒神经毒力
- 乙型脑炎病毒NS3蛋白对病毒增殖及毒力的影响
- 2020年
- 目的探讨乙型脑炎病毒NS3蛋白对病毒增殖及毒力的影响。方法利用感染性克隆技术构建以乙脑病毒疫苗株为骨架,用野毒株NS3替换疫苗株相应区域的病毒感染性克隆,体外转录获得RNA,再通过电转染BHK-21细胞拯救病毒,通过噬斑试验、免疫荧光试验和测序鉴定病毒,通过生长曲线、CCK-8检测和动物试验观察和评价嵌合病毒的增殖能力和神经毒力。结果酶切和测序表明JEV(V)/NS3(W)嵌合病毒感染性克隆构建成功,并经病毒测序和免疫荧光试验证实成功拯救病毒;蚀斑实验显示:嵌合病毒蚀斑直径(2.92±0.08)mm大于JEV SA14-14-2疫苗株蚀斑直径(1.90±0.10)mm(P<0.01),与野毒株SA14噬斑直径(2.96±0.13)相似(P>0.05);生长曲线显示,用M.O.I=0.01接种BHK21细胞后,嵌合病毒48 h达到滴度高峰(8.9 log10PFU/mL);接种BHK21细胞72 h后,CCK-8显示:嵌合病毒组细胞的增殖活性(24.9±1.3)%低于疫苗组(41.4±1.8)%(P<0.01),高于野毒株组(17.7±0.5)%(P<0.01),但动物试验显示嵌合病毒神经毒力(LD50=124.5 PFU/0.02 ml))弱于疫苗株(LD50=7.7 PFU/0.02 ml)。结论乙脑病毒NS3蛋白对病毒的增殖和毒力均有一定影响,但体内和体外实验结果存在差异。
- 唐丽萍李玥珂任阳冯亚岚黄荣袁磊彭丽娟杨健
- 关键词：乙型脑炎病毒非结构蛋白毒力
- 寨卡病毒包膜蛋白Y158H突变对乙脑/寨卡嵌合病毒感染小鼠脑内神经毒力的影响被引量：1
- 2021年
- 目的研究乙脑/寨卡嵌合病毒(Japanese encephalitis/Zika chimeric virus,JE/ZIKV)包膜蛋白(envelope protein,E蛋白)第158位氨基酸Y158H突变对感染小鼠脑内神经毒力的影响。方法运用重叠延伸PCR技术和基因克隆技术构建含Y158H突变全长cDNA的质粒,单酶切形成线性化DNA分子后体外转录获得RNA,电转染BHK21细胞完成重组病毒包装。通过病毒基因测序、间接免疫荧光试验、生长曲线及蚀斑试验鉴定病毒,通过动物试验评价病毒的小鼠脑内神经毒力。结果基因测序和酶切证实,成功构建含突变位点Y158H全长cDNA质粒。蚀斑试验和病毒基因测序、间接免疫荧光试验证实成功完成病毒的拯救,JE/ZIKV蚀斑直径(1.7±0.2)mm,JE/ZIKV(Y158H)蚀斑直径(1.6±0.1)mm,两种病毒的蚀斑大小差异无统计学意义(P>0.05)。两种病毒增殖规律相似,但整个过程中JE/ZIKV(Y158H)的增殖效率略低于母本病毒。分别用两种病毒进行动物试验,JE/ZIKV(Y158H)的LD50为58.93 PFU/0.03 ml,JE/ZIKV为2.21 PFU/0.03 ml,JE/ZIKV(Y158H)的毒力低于JE/ZIKV。结论ZIKV E蛋白Y158H位点突变可降低嵌合病毒对小鼠脑内神经毒力,E158是影响E蛋白神经毒力的重要氨基酸之一。
- 李玥珂冯亚岚任阳陈岚黄荣周仲辉杨健
- 关键词：E蛋白突变神经毒力
