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猪TOLL样受体7全基因的扩增、克隆及生物信息学分析被引量：4: 2013年; 根据猪Toll样受体7基因(TLR7)序列设计、合成1对引物,直接从三元猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增三元猪TLR7全基因,并进行克隆和测序。测序结果表明,获得了三元猪TLR7全基因序列,其大小为3 160 bp,包含一个完整阅读框(3 153 bp),编码1 051个氨基酸残基,有15个潜在的N-糖基化位点和4个潜在的磷酸化位点,信号肽切割部位位于第29～30位氨基酸之间,跨膜基因序列为第844～866位。TLR7基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。三元猪TLR7基因的成功克隆为进一步研究猪TLR7基因表达、生物学功能、揭示ssRNA病毒入侵宿主的致病机制以及猪抗病毒免疫及育种的相关研究奠定了基础。; 钞安军吴宇阳李坤卢权威崔保安陈红英; 关键词：三元猪克隆进化分析

猪α干扰素基因在干酪乳酸杆菌中的表达: 从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪α干扰素(IFN-α)基因成熟蛋白序列,克隆到含有信号肽的质粒pUCK-SP中,获得重组质粒pUCK-SP-IFN-α。再将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切获取的SP-IFN-α片段插入到同...; 陈红英马世杰李坤付朋飞郭晓庆高晓云崔保安; 关键词：猪Α干扰素基因表达抗病毒活性; 文献传递

猪α干扰素基因在干酪乳酸杆菌中的表达: 从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪α干扰素(IFN-α)基因成熟蛋白序列,克隆到含有信号肽的质粒pUCK-SP中,获得重组质粒pUCK-SP-IFN-α。再将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切获取的SP-IFN-α片段插入到同...; 陈红英马世杰李坤付朋飞郭晓庆高晓云崔保安; 关键词：猪Α干扰素抗病毒活性; 文献传递

猪细小病毒河南地方株HP104的分离与生物学特性鉴定被引量：3: 2013年; 采用PCR方法对河南采集的疑似PPV病料进行PCR检测，PCR检测为阳性的病料接种猪睾丸细胞，分离到1株病毒，命名为HP104。通过观察细胞病变（CPE）、病毒滴度TCID50和血凝效价的测定、理化特性试验等研究病毒的特性，利用电镜观察病毒的形态，NSI基因PCR扩增及测序分析。该病毒在sT细胞上连续盲传10代后，细胞出现了较稳定的CPE，传代至第15代时病毒血凝效价基本稳定为2，到第20代时TcID50达到10TCID／0．1mL左右。该毒株对热、pH3．0酸、氯仿、胰蛋白酶有抗性。在电镜下可观察到近似球形的病毒粒子，大小约23～26nm。PCR扩增产物与预期一致，与其他PPV毒株NSI基因序列同源性高达99％以上。该病毒特征与猪细小病毒特征基本相符，初步证实分离的病毒为猪细小病毒。; 吴宇阳陈龙彪崔保安王林青卢权威钞安军李坤魏战勇陈红英; 关键词：猪细小病毒

猪α干扰素基因在干酪乳酸杆菌中的表达: 粒pMD 18-IFN-cα扩增出猪α干扰素(IFN-α)基因成熟蛋白序列,克隆到含有信号肽的质粒pUCK-SP中,获得重组质粒pUCK-SP-IFN-α.再将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切获取的SP-IFN-α片段插入到同...; 马世杰李坤高晓云付朋飞郭晓庆崔保安陈红英; 关键词：基因表达

猪IFN-α基因在干酪乳酸杆菌中的表达及反应活性鉴定: 2015年; 【目的】构建能够稳定表达猪α-干扰素(IFN-α)成熟蛋白的重组干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei CECT5276),为将其作为口服疫苗来提高动物机体免疫力奠定基础。【方法】从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪IFN-α成熟蛋白基因,再将其定向克隆到干酪乳酸杆菌整合型表达载体pMJ67的lac启动子下游,得到重组质粒pMJ67-IFN-α,电穿孔转化干酪乳酸杆菌。抽提干酪乳酸杆菌基因组DNA,进行PCR扩增及测序鉴定。采用半定量RTPCR检测猪IFN-αmRNA在干酪乳酸杆菌中的转录水平;采用Western blot对重组干酪乳酸杆菌菌体进行分析,检测其表达产物的活性;用双抗体夹心ELISA法确定最适的乳糖诱导质量浓度。【结果】PCR扩增获得了501bp的IFN-α,成功构建了重组质粒pMJ67-IFN-α,转化干酪乳酸杆菌后获得了重组乳酸杆菌。半定量RT-PCR结果显示,IFN-αmRNA在诱导16h时表达水平最高;Western blot分析表明,构建的重组干酪乳酸杆菌成功表达出了相对分子质量约19ku的重组蛋白,其可与鼠抗猪IFN-α抗体发生特异性反应。ELISA结果表明,当乳糖诱导质量浓度达到8g/L时,猪IFN-α成熟蛋白的表达量达到最大,为1.3μg/L。【结论】将猪IFN-α成熟蛋白基因整合到干酪乳酸杆菌基因组中,构建的重组乳酸杆菌能够稳定表达猪IFN-α成熟蛋白。; 马世杰李坤付朋飞郭晓庆高晓云崔保安陈红英; 关键词：电力系统

猪圆环病毒2型和猪细小病毒混合感染的PCR检测被引量：1: 2013年; 2012年9月河南省新乡市某养猪场发生一例以初产母猪流产、死产,断奶仔猪精神沉郁、呼吸困难、食欲不振、轻微腹泻、渐进性消瘦为特征的疾病。采用PCR技术进行检测,结果表明猪圆环病毒2型和猪细小病毒均为阳性,结合发病情况、临床症状及剖检变化,初步确定为PCV2和PPV混合感染。; 吴宇阳陈龙彪王林青崔保安卢权威钞安军李坤陈红英魏战勇; 关键词：猪圆环病毒2型猪细小病毒 PCR检测

猪细环病毒和猪圆环病毒2型混合感染的检测被引量：1: 2012年; 为诊断中牟某猪场送检病料的感染类型,调查了其流行病学、临床症状和病理剖检特征,并采用PCR检测技术对其进行检测。结果表明,该猪场存在猪细环病毒与猪圆环病毒2型的混合感染。; 王子馨李坤崔保安王淑娟陈红英张宇耕; 关键词：猪圆环病毒2型

PCV2 ORF2基因与猪IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性被引量：4: 2013年; 为研制新型的PCV2基因疫苗,本研究将PCV2ORF2和猪IL-18基因插入真核表达质粒pIRES中,构建共表达capsid(Cap)蛋白和猪IL-18的质粒pIRES-OFR2/IL18和表达Cap蛋白的质粒pIRES-OFR2。将质粒pIRES-OFR2/IL18和pIRES-OFR2通过腿部肌肉多点注射8周龄昆明小鼠,间隔3周再免疫1次。加强免疫3周后用PCV2Wuzhi株进行攻毒。pIRES-OFR2/IL18免疫昆明小鼠后能促进外周血T淋巴细胞增殖和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强PCV2DNA疫苗对强毒的攻击保护,pIRES-ORF2/IL18免疫组要优于pIRES-ORF2免疫组及其它对照组,差异显著。表明猪IL-18基因与PCV2ORF2共表达可增强猪体对DNA疫苗的免疫应答,提高对PCV2强毒的抵抗力。; 王子馨李坤刘金朋崔保安王淑娟朱前磊陈红英; 关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因 DNA疫苗

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析被引量：6: 2013年; 【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）感染猪进行病毒分离鉴定，并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测，对检测为阳性的病料进行PCV2的分离，利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因，经克隆、测序后，用MEGA5．1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒，分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示，感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1767bp，与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92．6％～99．9％，2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96．0％，与PCV1核苷酸序列同源性分别为74．6％和77．7％。系统进化树分析结果显示，2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近；PCV2核苷酸序列比较稳定，其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2，ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a，JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。; 卢权威郭官鹏崔保安陈红英魏战勇郭敬吴宇阳李坤钞安军; 关键词：猪圆环病毒2型病毒分离全基因组

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李坤

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