郑秀平
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 供职机构：浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生环境科学与工程更多>>
- 捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定被引量：2
- 2017年
- 【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L^(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L^(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1) MgCl_2,60μmol·L^(-1)CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L^(-1)的反应体系(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1)MgCl_2,60μmol·L^(-1) CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.
- 郑秀平丁豪杰郭筱璐杨怡黄艳陈学秋周前进杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫原核表达酶活测定
- Hc-fau基因结构域功能及Hc-FAU天然融合蛋白现象的初步研究
- 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)为吸血性寄生虫,能够在L4早期阶段进入滞育状态来躲避不利于自身生存的恶劣条件。本研究旨在研究Hc-fau基因各结构域所发挥的功能以及Hc-FAU天然融合蛋白特性分析...
- 郭筱璐闫宝龙杨怡黄艳丁豪杰郑秀平陈学秋杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫
- 捻转血矛线虫-胃癌细胞共培养模型的建立及互作研究
- 捻转血矛线虫早期感染会引起宿主胃组织的病理反应，诱发宿主的早期免疫应答，如表达分泌警报因子，敦促宿主尽快建立完整的Th2型免疫保护力。本试验旨在建立捻转血矛线虫体外培养模型，并在此基础上研究体外线虫感染早期免疫应答。使用...
- 杨怡郭筱璐丁豪杰郑秀平黄艳陈学秋杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫MGCBGC细胞坏死
