温杰
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 供职机构：北京交通大学理学院生命科学与生物工程研究院更多>>
- 发文基金：中央高校基本科研业务费专项资金北京市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 稳定表达Aβ特异性单链抗体的哺乳动物细胞株构建和功能研究被引量：2
- 2017年
- 构建可以稳定表达Aβ特异性单链抗体(scFv)的哺乳动物细胞株。应用重叠延伸PCR的方法,以前期建立的Aβ特异性单克隆抗体(A8)的轻、重链可变区基因为模板,构建scFv的基因片段,通过(G_4S)_3或p2A两种不同的连接肽(Linker)序列,拼接得到多种形式的scFv基因片段,用于构建真核表达载体。利用脂质体分别转染人宫颈癌细胞(Hela)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO),Western blot鉴定scFv的表达情况;以潮霉素筛选获得稳定表达抗Aβ的scFv细胞株,以间接ELISA和斑点印迹分析所得scFv的抗原识别能力;采用体外细胞实验,在超微病理水平分析所得scFv的细胞保护作用。结果:成功构建了Aβ特异性scFv的3个真核表达载体pSecTag2/HygroA-VL-(G_4S)_3-VH、pSecTag2/HygroA-VH-(G_4S)_3-VL和pSecTag2/HygroA-VL-p2A-VH,获得了2株稳定表达Aβ特异性scFv的细胞株Hela-VL-p2A-VH和CHO-VL-(G_4S)_3-VH。Western blot结果表明了相应scFv的正确表达,间接ELISA和斑点印迹结果表明所分泌的细胞上清具有Aβ抗原识别能力,体外实验显示其具有阻断和抑制Aβ寡聚体细胞毒性的作用。稳定表达Aβ特异性单链抗体的细胞株有助于AD免疫治疗基础研究的进一步开展。
- 温杰宋琳琳张莹王荷何金生洪涛
- 关键词：阿尔茨海默病单链抗体
- 基于负染-电镜的Aβ体外聚集表征测试要点分析
- 2016年
- 本文应用电镜负染色技术,对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)中所涉及的β淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)的聚集规律进行了分析。通过对样品的浓度、p H值、温度和时间等设置系列梯度,以及调整负染试剂的种类、浓度和染色时间,优化了Aβ寡聚体样品制备以及电镜观察的最佳条件,获得了清晰的Aβ纤维图像并用以估算纤维长度。实验结果表明:经过六氟异丙醇给予单体化处理,并溶于无水二甲基亚砜(DMSO)的Aβ(100μmol·L^(-1)),在p H7.2的PBS中4℃孵育24 h,Aβ寡聚体形态清晰,且Aβ42寡聚体比Aβ40寡聚体聚集趋势更明显。在p H 8.0的硼酸缓冲液中,Aβ42(40μmol·L^(-1))在37℃孵育72 h后,纤维形成明显;而Aβ纤维样品经过煮沸后再制备负染样品,所得电镜图像更为清晰,便于对纤维长度和结构进一步分析。因此电镜负染色技术,可作为一种快捷,直观的Aβ体外聚集形貌表征的质控方法。
- 张钊董润敏张莹孙维敏王荷王欢杨海强温杰
- 关键词：透射电子显微镜Β-淀粉样蛋白
