王荷
- 作品数：9 被引量：4H指数：1
- 供职机构：北京交通大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 可表达新型甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建
- 2014年
- 根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株基因序列(A/California/07/2009(H1N1)),全基因合成甲型流感病毒血凝素(HA)编码基因,利用辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd)骨架质粒pSC15B,构建可表达HA基因的HDAd/HA DNA分子载体,以磷酸钙法转染293Cre4细胞,与辅助病毒H14连续共感染,获得HDAd/HA载体,并大量制备和纯化,进行形态观察和体外感染的初步鉴定。透射电镜下观察HDAd/HA载体具有典型腺病毒形态;与辅助病毒H14共感染293细胞,RT-PCR检测HA基因有转录,显示成功构建HDAd/HA重组腺病毒载体,为甲型流感病毒体内免疫效果和免疫保护作用的研究奠定实验基础。
- 张梅江彦泽陈念华付远辉乔伟王荷何金生
- 关键词：甲型H1N1流感病毒血凝素
- 稳定表达Aβ特异性单链抗体的哺乳动物细胞株构建和功能研究被引量：2
- 2017年
- 构建可以稳定表达Aβ特异性单链抗体(scFv)的哺乳动物细胞株。应用重叠延伸PCR的方法,以前期建立的Aβ特异性单克隆抗体(A8)的轻、重链可变区基因为模板,构建scFv的基因片段,通过(G_4S)_3或p2A两种不同的连接肽(Linker)序列,拼接得到多种形式的scFv基因片段,用于构建真核表达载体。利用脂质体分别转染人宫颈癌细胞(Hela)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO),Western blot鉴定scFv的表达情况;以潮霉素筛选获得稳定表达抗Aβ的scFv细胞株,以间接ELISA和斑点印迹分析所得scFv的抗原识别能力;采用体外细胞实验,在超微病理水平分析所得scFv的细胞保护作用。结果:成功构建了Aβ特异性scFv的3个真核表达载体pSecTag2/HygroA-VL-(G_4S)_3-VH、pSecTag2/HygroA-VH-(G_4S)_3-VL和pSecTag2/HygroA-VL-p2A-VH,获得了2株稳定表达Aβ特异性scFv的细胞株Hela-VL-p2A-VH和CHO-VL-(G_4S)_3-VH。Western blot结果表明了相应scFv的正确表达,间接ELISA和斑点印迹结果表明所分泌的细胞上清具有Aβ抗原识别能力,体外实验显示其具有阻断和抑制Aβ寡聚体细胞毒性的作用。稳定表达Aβ特异性单链抗体的细胞株有助于AD免疫治疗基础研究的进一步开展。
- 温杰宋琳琳张莹王荷何金生洪涛
- 关键词：阿尔茨海默病单链抗体
- 人tau蛋白N端结构域特异性单克隆抗体筛选及在血液检测中的应用被引量：1
- 2024年
- 微管相关蛋白tau抗体在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)及其他tau蛋白病的基础和临床研究中发挥重要作用。采用重组人tau441作为免疫原,通过细胞融合及有限稀释法筛选并获得分泌抗人tau蛋白N端结构域(tau N-terminal domain,NTD-tau)单克隆抗体杂交瘤细胞株,通过制备小鼠腹水及亲和层析获得纯化的单克隆抗体;分别采用间接ELISA检测其灵敏度,蛋白质印迹检测其特异性;建立并优化人tau蛋白双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,杂交瘤细胞克隆阳性率为83.6%,建立分泌ZD8F7单克隆抗体的稳定细胞株,细胞上清中抗体效价为1:16000;腹水中抗体效价高于1:256 000;纯化后单克隆抗体效价高于1:128 000;表位分析显示,ZD8F7单克隆抗体识别tau21-37位氨基酸,位于N端结构域;蛋白质印迹分析显示,ZD8F7单克隆抗体识别50-70 kDa重组人tau蛋白及转基因AD模型小鼠(APP/PS1/tau)脑组织中50 kDa的人tau蛋白;以ZD8F7单克隆抗体作为捕获抗体建立的人tau蛋白定量检测方法,线性范围在7.8-500.0 pg/mL,可以识别AD转基因小鼠脑组织以及血浆中的人tau蛋白,而不识别小鼠tau蛋白。综上,本研究制备的人NTD-tau特异性单抗和双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度高,为神经退行性疾病中tau蛋白检测提供了有力工具。
- 闫子迪张译文姜家龙刘振武王荷张莹何金生洪涛
- 关键词：双抗体夹心ELISA
- tau蛋白体外磷酸化表征分析
- 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种尚无法治愈的神经变性疾病。过度磷酸化的微管相关蛋白tau(hyperphosphorylated tau,p-tau)形成神经纤维缠结(neurofibr...
- 桂克巴利曹华奇曾锐王荷闫子迪张译文张莹何金生
- 关键词：阿尔茨海默病磷酸化TAU蛋白
- 阿尔茨海默病转基因小鼠脑内细胞因子动态水平分析研究
- 2019年
- 目的:天然免疫功能异常可能是导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的重要致病机制之一。本文旨在研究AD小鼠小胶质细胞早期极化失调的动态水平。方法:用电化学发光(mesoscale discovery, MSD)方法检测AD双转基因小鼠APPswe/PS1?E9(APP/PS1)小胶质细胞活化相关多种细胞因子(TNF-?、IL-6、IL-1?、IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-?、IL-2和IL-5)的动态变化水平,研究AD模型小鼠(APP/PS1)天然免疫调控与AD小鼠月龄增长之间变化的动态规律。结果:在小鼠脑组织中,随着小鼠年龄的增加(3 w、6 w、10 w、16 w、20 w和24 w),小胶质细胞炎症因子呈现一定的极化趋势。并且,与野生型相比,APP/PS1小鼠炎症因子TNF-?、IL-6、IL-1?呈现相反的变化趋势。检测10 w-16 w时段TNF-?,两组间差异显著(p<0.05)。10 w以上,与野生型(WT)相比,转基因(APP)组IFN-?上升明显(p<0.05)结论:综上,AD早期存在了增龄相关的小胶质细胞的活化,其机制值得进一步研究。
- 周子杨杨贻然李江弢王荷姜家龙张莹
- 关键词：阿尔茨海默病天然免疫细胞因子
- 基于负染-电镜的Aβ体外聚集表征测试要点分析
- 2016年
- 本文应用电镜负染色技术,对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)中所涉及的β淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)的聚集规律进行了分析。通过对样品的浓度、p H值、温度和时间等设置系列梯度,以及调整负染试剂的种类、浓度和染色时间,优化了Aβ寡聚体样品制备以及电镜观察的最佳条件,获得了清晰的Aβ纤维图像并用以估算纤维长度。实验结果表明:经过六氟异丙醇给予单体化处理,并溶于无水二甲基亚砜(DMSO)的Aβ(100μmol·L^(-1)),在p H7.2的PBS中4℃孵育24 h,Aβ寡聚体形态清晰,且Aβ42寡聚体比Aβ40寡聚体聚集趋势更明显。在p H 8.0的硼酸缓冲液中,Aβ42(40μmol·L^(-1))在37℃孵育72 h后,纤维形成明显;而Aβ纤维样品经过煮沸后再制备负染样品,所得电镜图像更为清晰,便于对纤维长度和结构进一步分析。因此电镜负染色技术,可作为一种快捷,直观的Aβ体外聚集形貌表征的质控方法。
- 张钊董润敏张莹孙维敏王荷王欢杨海强温杰
- 关键词：透射电子显微镜Β-淀粉样蛋白
- 重组人GSK-3β制备及tau磷酸化活性研究
- 2023年
- 目的:表达和纯化重组人糖原合成激酶-3β(glycogen synthetic kinase-3β,GSK-3β),优化反应条件,分析GSK-3β对tau蛋白磷酸化修饰产物p-tau的生物活性。方法:构建GSK-3β原核和杆状病毒表达载体,镍亲和层析纯化,BCA法测定蛋白浓度,考马斯亮蓝染色分析纯度;免疫印迹(Western blot)鉴定GSK-3β免疫反应性;液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和斑点印迹检测GSK-3β的tau磷酸化情况;优化GSK-3β磷酸化体系中GSK-3β和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的浓度;负染透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)和硫磺素T(thioflavine-T,ThT)结合实验分析磷酸化产物形成纤维的情况;CCK8实验分析磷酸化产物的细胞毒性。结果:考马斯亮蓝染色显示,原核和杆状病毒表达的重组人GSK-3β蛋白表观分子量位于50 kDa左右,蛋白纯度分别为86%和81%;Western blot在相应位置有特异条带;LC-MS提示,经GSK-3β处理的tau蛋白有23个磷酸化位点;斑点印迹显示,兔抗pT181血清、兔抗pT217和pS404识别磷酸化的tau蛋白;优化反应条件,tau、GSK-3β和ATP的最适反应浓度分别为1μmol/L、5μmol/L和3.2 mmol/L;制备的GSK-3β对tau蛋白pT217位点磷酸化信号强于国外商品(P<0.05);TEM显示p-tau 5 d出现纤维结构,而tau未见明显的纤维结构;ThT结合实验检测到磷酸化产物的荧光值增强(P<0.05);磷酸化产物的细胞毒性增强(P<0.05)。结论:成功制备并鉴定了重组人GSK-3β,可催化tau蛋白在第181、217和404位氨基酸磷酸化,为阿尔茨海默病的基础研究提供了技术支撑。
- 刘振武王荷闫子迪张莹何金生
- 重组人tau441 (P301S)蛋白表达纯化及生物学特性分析被引量：1
- 2021年
- 目的初步了解重组人tau441(P301S)蛋白体外聚集、抗原性及免疫原性等生物学性质。方法原核表达带His标签的tau441(P301S)重组质粒,镍亲和层析纯化重组蛋白,BCA测定蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色确定蛋白的纯度;采用Western blot(WB)和负染透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)鉴定;间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测所得蛋白的抗原性;以重组蛋白免疫小鼠,检测免疫血清特异性抗体滴度来分析其免疫原性。结果所得重组人tau441(P301S)纯度为70%,WB显示在相对分子质量(Mr.×10^(3))64和更高相对分子质量处有特异性条带。TEM显示,tau441(P301S)呈絮状团块聚集,团状面积显著大于tau441野生型蛋白(t=6.439,P=0.003);4℃孵育9 d后,tau441(P301S)形成明显的纤维状结构。间接ELISA结果显示,tau441(P301S)能被tau单抗HT7(1∶80000)识别;小鼠免疫血清tau特异性抗体滴度达到1∶128000,且WB显示,免疫后血清识别阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)转基因小鼠脑裂解抽提物。结论重组人tau441(P301S)蛋白具有体外聚集性增强的特性但其抗原性和免疫原性未改变。
- 姜家龙刘振武王子奇聂中梁李培昀王荷张莹何金生洪涛
- 关键词：阿尔茨海默病微管相关蛋白
- EGFP-LC3稳定细胞系的建立及对Aβ自噬效应的研究
- 2015年
- 该文建立了稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系,以10μmol/L的Aβ肽及其不同疏水性氨基酸含量的截短形式处理细胞24 h,计数LC3的荧光斑点数;Western blot检测LC3B表达量的变化;MTT检测特定Aβ诱导细胞自噬后对细胞活性的差异;用透射电镜确认自噬体的细胞超微结构。结果显示,G418(700μg/m L)筛选6周后,建立了稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系;Aβ25-35、Aβ40和Aβ42诱导细胞内LC3荧光斑点的效果较明显;Western blot结果显示LC3B的酯化,即LC3BI向LC3BII转变;MTT检测发现,与Aβ40相比,Aβ42处理后伴随自噬的细胞毒性更强;电镜可以见到Aβ诱导的自噬小体。提示,Aβ肽及其截短的疏水性片段均可诱导自噬,且诱导自噬的效果与疏水性氨基酸含量无关;同时,Aβ42细胞损伤强于Aβ40。该研究为进一步探讨AD自噬机制提供了实验基础。
- 房芳张莹彭向雷王荷张钊郑妍鹏
