董彬
- 作品数：8 被引量：24H指数：4
- 供职机构：天津科技大学食品工程与生物技术学院教育部食品营养与安全重点实验室更多>>
- 发文基金：天津市应用基础与前沿技术研究计划天津市应用基础与前沿技术研究计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT27的原核表达、纯化及多克隆抗体制备被引量：10
- 2016年
- [目的]制备莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT27的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻ift27基因的cDNA序列构建了原核表达载体p ET28a-ift27和p MAL-C2X-ift27,转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,获得了6×His/MBPIFT27两种重组融合蛋白。将纯化后的MBP-IFT27融合蛋白免疫新西兰大白兔,5次后采集抗血清,间接ELISA法测定效价,并对抗血清依次经protein A和抗原抗体两步纯化后使用Western Blot和免疫荧光对抗体特异性进行检测。[结果]MBP/6×His-IFT27融合蛋白表达后分子量分别为27 k Da和67 k Da。ELISA测定其效价为1∶256 000,Western Blot检测可特异性识别莱茵衣藻中的IFT27蛋白,免疫荧光结果显示可检测到纤毛中的IFT27蛋白。[结论]制备出特异性抗莱茵衣藻IFT27的多克隆抗体,效价为1∶256 000,Western Blot可特异性检测到莱茵衣藻中IFT27蛋白的目的条带,免疫荧光可定位IFT27在细胞内分布。
- 董彬吴松王晶孟德梅樊振川
- 关键词：莱茵衣藻纤毛表达纯化多克隆抗体
- 莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT70的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备被引量：4
- 2017年
- 目的原核表达及纯化莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT70,并制备其多克隆抗体。方法以质粒p GAD-ift70(含莱茵衣藻ift70基因N-末端编码380个氨基酸的核酸序列)为模板,分别构建带有6×His和MBP标签的原核表达质粒p ET-28A-ift70和p MAL-C2X-ift70,转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达6×His-IFT70和MBP-IFT70融合蛋白,并进行亲和层析。将纯化的MBP-IFT70融合蛋白免疫2只新西兰大白兔,经耳动脉采血,分离血清,ELISA法测定抗体效价,经两步亲和纯化后进行Western blot及免疫荧光法分析。结果经双酶切及测序鉴定证明原核表达质粒p ET-28A-ift70和p MAL-C2X-ift70构建正确。6×His-IFT70和MBP-IFT70融合蛋白的相对分子质量分别为40 000和80 000,纯化后纯度可达90%。家兔1及家兔2抗血清的效价分别为>128 000及>256 000,纯化的抗血清可与莱茵衣藻IFT70蛋白发生特异性结合,于相对分子质量约70 000处可见特异性结合条带,可与野生型莱茵衣藻CC-125纤毛上的IFT70蛋白发生特异反应,荧光显微镜下可见红色荧光。结论成功制备了抗莱茵衣藻IFT70的多克隆抗体,为IFT70在IFT和纤毛组装中作用的深入研究奠定了基础。
- 董彬王震刘雁霞孟德梅樊振川
- 关键词：莱茵衣藻纤毛原核细胞多克隆抗体
- 莱茵衣藻作为绿色细胞工厂生产高附加值重组蛋白的研究进展被引量：3
- 2017年
- 重组蛋白广泛用于医疗、养殖、食品等领域.利用单细胞绿藻——莱茵衣藻为绿色细胞工厂生产重组蛋白的研究在很长时间以来便引起了广泛的关注.相对于传统细胞工厂,这种光合真核微生物在生产高附加值蛋白方面具有众多潜在优势,包括具备准确折叠和组装复杂蛋白的能力、规模化培养时间短、生物安全性高和生产成本低廉等.目前,利用莱茵衣藻叶绿体基因组和核基因组已成功表达了多种重组蛋白,如蛋白亚基疫苗、单链抗体、蛋白细胞因子、蛋白(肽)类激素和工业养殖业用酶等,初步证实了莱茵衣藻作为绿色细胞工厂方面的实用性.本文阐释了莱茵衣藻作为绿色细胞工厂生产高附加值重组蛋白的优势和目前已取得成就的典型案例,并对今后需要克服的困难进行了讨论.
- 樊振川吕玉洁刘雁霞王晶董彬孟德梅
- 关键词：莱茵衣藻重组蛋白
- 莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备被引量：2
- 2018年
- IFT25是维持纤毛运动和感知所必须元件纤毛内运输蛋白IFT复合物B中的重要组分之一,探索IFT25尤其在模式生物莱茵衣藻中的作用机制具有重要作用。作者采用经济和简单的方法,制备莱茵衣藻IFT25的兔源多克隆抗体。将ift25分别连接到pMAL-c2X-和pET-28a(+)-载体上,转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导大量表达,并经亲和纯化后蛋白质纯度超过90%。通过颈背部皮下多次免疫8周龄大的新西兰大白兔,制备多克隆抗体,取第五次免疫后血清用ELISA测定效价超过128 000。抗血清依次经过Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blotting检测抗体特异性,结果表明制备的抗体可以特异性识别莱茵衣藻中的IFT25,为IFT25作用机制的阐明和纤毛相关疾病的诊断提供了重要理论和方法支持。
- 王震董彬樊振川孟德梅
- 关键词：莱茵衣藻纤毛原核表达蛋白纯化多克隆抗体
- 莱茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：8
- 2016年
- IFT139是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)纤毛内运输蛋白IFT复合物A中的一个重要组分.其编码基因的突变、缺失或沉默将会影响纤毛正常的组装和解聚,进而导致纤毛病的产生.为深入研究IFT139的作用机制,本实验首先PCR获得ift139 5′端458 bp的EST片断,成功构建了p MAL-c2-ift139与p ET-28a(+)-ift139重组质粒.然后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,分别得到相对分子质量为6.0×104和2.5×104的重组MBP/HIS-IFT139融合蛋白.进一步将亲和纯化的MBP-IFT139融合蛋白(纯度95%,以上),免疫新西兰大白兔获得抗血清,间接ELISA法测得血清效价为1﹕256,000.最后将抗血清依次经Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blot检测抗体特异性,结果显示所制备抗体能够正确特异性识别莱茵衣藻中的IFT139,从而为IFT139作用机制的阐明和纤毛相关疾病的研究奠定了重要基础.
- 田伟董彬李镇芳孟德梅樊振川
- 关键词：莱茵衣藻纤毛表达纯化多克隆抗体
- 绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定被引量：5
- 2017年
- 绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和p GEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为2.6×10~4和5.2×10~4的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.
- 董彬胡贺贺王晶孟德梅樊振川
- 关键词：原核表达蛋白纯化多克隆抗体免疫印迹
- 莱茵衣藻纤毛内运输蛋白IFT46的原核表达纯化及其多克隆抗体的制备被引量：12
- 2016年
- IFT46是纤毛内运输蛋白IFT复合物B(IFT-B)的一个重要组分,对于纤毛的组装、运动和感知发挥着重要作用。为深入研究IFT46的作用机制,利用ift46基因全序列分别构建了带有GST和MBP标签的原核表达载体p GEX-2T-ift46和p MAL-C2X-ift46,并转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,以15%SDS-PAGE鉴定,分别获得了分子量为70、86 k Da的重组GST/MBP-IFT46融合蛋白。将亲和纯化的GST-IFT46融合蛋白(纯度95%以上)免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1∶256 000。抗血清依次经Protein A和固定在MBP-IFT46纯化后,用Western blotting和免疫荧光检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别莱茵衣藻中的IFT46,而且发现IFT46绝大部分定位在纤毛基体,极少部分沿纤毛呈点状分布,为继续开展IFT46在肥胖症、糖尿病、多囊肾病等纤毛相关疾病中作用机制的研究奠定了重要基础。
- 任海月董彬樊振川孟德梅
- 关键词：莱茵衣藻纤毛原核表达蛋白纯化多克隆抗体
- 莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定被引量：1
- 2019年
- BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2基因5'端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明:分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。
- 董彬吴松程荣强孟德梅樊振川
- 关键词：莱茵衣藻纤毛原核表达蛋白纯化多克隆抗体
