邓凯
- 作品数：15 被引量：15H指数：2
- 供职机构：广西大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划广西省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 水牛胎儿骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性研究
- 引言/目的 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞.相关报道指出胎儿骨髓中的BMSCs无论从数量还是分化潜能性都优于成年动物.研...
- 雷钏邓凯阮秋燕马玉洁阮子芸刘晓华蒋建荣石德顺陆凤花
- 水牛asf1a基因克隆及高效敲除靶位点的筛选被引量：1
- 2019年
- 本研究旨在对水牛anti-silence factor 1a (asf1a)基因进行克隆并行生物信息学分析,并进一步筛选基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的高效敲除asf1a基因位点。根据NCBI公布的牛asf1a基因mRNA序列设计特异性引物,以水牛GV期卵母细胞RNA反转录后的cDNA作为模板,通过PCR技术克隆获得asf1a基因序列片段,利用生物信息学分析方法,对克隆得到的序列进行和相应翻译的蛋白质进行了分析。在克隆得到的水牛asf1a基因序列上筛选3个PAM位点,并根据PAM位点构建3个gRNA载体(g1、g2、g3)以及相应的RGS载体,将pcDNA3.1-h Cas9连同gRNA、RGS 3种质粒按照3∶1∶1比例共转293T细胞,筛选高效的CRISPR/Cas9敲除位点。试验以水牛GV期的卵母细胞RNA作为模板,通过RT-PCR技术克隆获得asf1a基因序列,并据测序结果设计靶向区域筛选高效asf1a基因敲除位点。结果发现,水牛asf1a基因CDS区全长615 bp,编码204个氨基酸;多重序列分析显示,水牛asf1a基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%,98%,97%,96%,93%;蛋白质结构预测分析发现存在ASF1-hist-chap等结构,二级结构含有9个α螺旋、12个β折叠、14个T转角、14个无规则卷曲。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最接近。根据水牛asf1a设计的敲除载体转染293T和成纤维细胞后,细胞基因组进行T7E1酶切的结果表明,g1位点对水牛成纤维细胞敲除效率最高,达到93.82%,同时,sanger测序表明效率达17/20。本研究成功克隆了水牛asf1a基因和分析了其生物学信息,同时筛选出了asf1a的高效敲除位点,为研究水牛asf1a基因功能奠定基础。
- 刘晓华邓凯范威宏黄永军杜姗姗冯万有潘尔科卢嘉卡文冬梅陆凤花石德顺
- 关键词：水牛克隆
- 一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法
- 本发明一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，属于生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域。所述方法包括：(1)、用于构建转基因克隆胚胎的转外源基因水牛胎儿成纤维细胞的制备；(2)、用于构建转基...
- 陆凤花石德顺刘晓华吴柱莲邓凯罗婵刘庆友邓彦飞蒋建荣李湘萍韦英明
- 文献传递
- 沼泽型水牛KDM4A(JMJD2A)基因克隆分析与表达模式
- 2019年
- 旨在克隆并分析水牛赖氨酸特异性去甲基化酶4A(lysine-specific demethylase 4A,KDM4A)基因,并检测其在水牛不同组织中的表达情况,探讨KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能。提取卵巢组织的RNA,获得水牛KDM4A基因CDS区的全长序列。结果显示,水牛KDM4A基因编码区全长3151bp,编码1067个氨基酸。水牛KDM4A基因与黄牛、绵羊、骆驼和家犬的同源性分别为99%,97%,92%,91%;且在不同物种间高度保守,符合生物的进化规律。KDM4A蛋白包含369个α-螺旋,85个β-转角,409个无规卷曲和204个延伸链,为亲水不稳定的酸性蛋白。qRT-PCR结果显示,KDM4A在水牛肌肉、肺脏、卵巢、大脑、皮肤、心脏、脾脏、肾脏和肝脏组织中均有表达,其中肌肉、肺脏、卵巢中表达量较高,肝脏和肾脏中表达量较低。本研究克隆得到了沼泽型水牛KDM4A基因,并对不同组织内KDM4A进行了基础的生物信息学分析,为阐明KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能,提高水牛胚胎发育水平提供理论基础。
- 许洁赵鑫俸云史鹏飞邓凯沈朋雷文冬梅王露露石德顺陆凤花
- 关键词：水牛组蛋白修饰克隆分析胚胎发育
- 水牛卵母细胞GV/MⅡ期对应卵丘细胞miRNA差异表达分析被引量：6
- 2017年
- 本研究旨在建立水牛卵母细胞体外成熟培养前后GV/MⅡ(Germinal vesicle,GV)/(MetaphaseⅡ,MⅡ)期对应的卵丘细胞miRNA数据库,筛选两个时期差异表达的miRNAs,为进一步阐明miRNA通过调控卵丘细胞中基因表达进而在卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用提供科学依据。分别收集水牛GV/MⅡ期的卵丘细胞,提取总RNA,利用Solexa测序技术获取小RNA测序数据,并进行生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了GV/MⅡ期卵丘细胞miRNA的表达谱,发现相对于GV期卵丘细胞,miRNA在MⅡ期卵丘细胞中表达差异显著上调的有24个,表达差异显著下调的有45个。采用qRT-PCR技术对随机筛选的8个miRNAs进行验证,证实其表达水平和RNA-seq分析结果相一致。结合靶基因预测和KEGG富集分析,获得了276条显著富集的信号通路;同时对富集前20的信号通路进行归纳总结,推测差异表达的miRNAs主要是通过细胞增殖、凋亡,物质代谢,细胞连接等途径在卵丘细胞中发挥作用。
- 沈朋雷秦希玲尹倩郭振伟邓凯杜姗姗尹娜阮子芸石德顺陆凤花
- 关键词：水牛卵丘细胞MIRNAS
- 水牛Novel-miR-57对Bcap-37和BMECs细胞DOK4基因的调控作用被引量：2
- 2021年
- 【目的】筛选Novel-miR-57调控靶基因,并明确其对靶基因的调控作用及生物功能,为揭示水牛乳腺上皮细胞(BMECs)的分化机理提供科学依据。【方法】利用MiRscan预测Novel-miR-57二级结构;以自编软件Ensembl(v80)注释的水牛mRNA截取3'-非翻译区(3'-UTR)作为预测数据库,采用Miranda(v3.3a)对Novel-miR-57进行靶基因预测;运用实时荧光定量PCR筛选重点靶基因。以化学合成的Novel-miR-57模拟物Mimics和抑制剂Inhibitor,分别转染人类乳腺癌细胞(Bcap-37)及BMECs细胞,以验证Novel-miR-57与靶基因的表达相关性。【结果】Novel-miR-57前体序列形成7个茎环结构,成熟序列位于第1、2和3个茎环结构间,其结合自由能为-53.70 kcal/mol。以结合自由能低于-20.00 kcal/mol为标准,最终筛选出34个可能的靶基因,共与42条KEGG信号通路存在关联,其富集的信号通路主要有代谢通路(ID:bta01100)、PI3K-Akt信号通路(ID:bta04151)、MAPK信号通路(ID:bta04010)和细胞因子—细胞因子受体相互作用(ID:bta04060)等;经实时荧光定量PCR检测分析发现DLX3、CANCNG3、DOK4、NFKBID、C17orf53、RTN1和FBXO10等7个靶基因在非泌乳期的相对表达量极显著高于泌乳期(P<0.01),二者间相差100.0倍以上,且与NovelmiR-57的相对表达量呈负相关。7个靶基因中仅DOK4基因与Novel-miR-57的表达具相关性,以200 nmol/L Inhibitor转染B-cap37细胞能显著提高DOK4基因表达(P<0.05,下同),添加100 nmol/L Mimics则显著抑制DOK4基因表达。以100 nmol/L Mimics转染BMECs细胞,Novel-miR-57和DOK4基因的相对表达量显著提高;而以200 nmol/L Inhibitor转染BMECs细胞,Novel-miR-57和DOK4基因的表达均受到显著抑制。【结论】Novel-miR-57含有7个茎环结构,且其成熟序列位于第1~3个茎环上。Novel-miR-57过表达可下调Bcap-37细胞DOK4基因表达或上调BMECs细胞DOK4基因表达,即Novel-miR-57对靶基因的调控作用因乳腺细胞生理状态不同而存在差异。
- 蔡小艳李雅辉鲍正潘陈秋萍李胜周宇邓凯石德顺刘庆友
- 关键词：水牛靶基因
- 水牛泌乳期与非泌乳期乳腺组织miRNAs表达谱鉴定及差异表达分析被引量：2
- 2017年
- 旨在鉴定分析水牛乳腺泌乳期和非泌乳期miRNA的表达谱和差异作用机制。采集水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织,利用Solexa测序技术构建2个时期miRNAs表达谱,鉴定前体miRNAs、成熟miRNAs和新miRNAs,分析miRNAs的第一偏好性核苷酸和染色体分布,发掘水牛泌乳期和非泌乳期高表达及差异表达miRNAs。结果显示,本研究构建了水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织2个miRNA表达谱,分别获得12 768 110和12 569 467条18~31nt的高质量序列。测序确认了归属259个miRNAs家族的359个成熟miRNAs和363个pre-miRNAs及5个水牛特有的miRNAs。U是19和25nt miRNAs的5′端最普遍的核苷酸。bbu-let-7b、bbu-let-7a、miR-26a和miR-21等miRNAs在2个时期均呈现高表达;bbu-miR-148a、143、200c、200a和bbu-let-7f等miRNAs在非泌乳期特异性高表达。bbu-miR-125b、29a和bbu-let-7c等miRNAs在泌乳期特异性高表达。bbu-miR-148a、143、200a、141和30a-5p等miRNAs在泌乳期的表达量下降为非泌乳期的1/2以下。而bbu-miR-26a、29a、125b、99a和bbulet-7c等miRNAs在泌乳期表达量大于或等于2倍非泌乳期丰度。本研究构建了水牛泌乳期以及非泌乳期乳腺组织2个miRNAs表达谱,测序确认了259个水牛miRNAs家族的359个成熟miRNAs和363个前体miRNAs,5个水牛特有miRNAs和10个高差异表达miRNAs,为进一步阐明奶水牛泌乳关键miRNAs作用机制奠定了基础。
- 蔡小艳鲍正攀古景开邓凯张晓溪任艳萍沈朋雷石德顺刘庆友
- 关键词：水牛乳腺组织信号通路
- 没食子酸对黄牛卵母细胞体外成熟的影响被引量：1
- 2018年
- 试验旨在研究没食子酸(gallic acid,GA)对黄牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响,进一步优化黄牛卵母细胞体外成熟体系。在卵母细胞体外成熟液(M液)中添加不同浓度没食子酸(0、10、30、50、100μmol/L),成熟22~24h后,统计卵丘扩展情况及卵母细胞成熟率;同时,对成熟的卵母细胞进行正常体外受精(IVF),统计早期胚胎的分裂率、囊胚率、囊胚卵裂球数及卵裂球细胞凋亡率。根据试验结果,选择最优浓度,使卵母细胞在含该浓度没食子酸的成熟液中成熟24h后,检测其细胞内的活性氧水平(ROS)和总谷胱甘肽(TGSH)含量。结果显示,M液中添加30μmol/L没食子酸组卵丘扩展分值和成熟率显著高于对照组(0μmol/L)(P<0.05),其他处理组与对照组无显著差异(P>0.05);成熟的卵母细胞体外受精后进行后续胚胎培养,其中10和30μmol/L组的分裂率均显著高于对照组和100μmol/L组(P<0.05),50和100μmol/L组分裂率较对照组也有所提高,但差异不显著(P>0.05);早期囊胚率统计发现,与对照组相比,30和100μmol/L能够显著提高囊胚发育率(P<0.05),10和50μmol/L浓度组则无显著差异(P>0.05);与对照组相比,30、100μmol/L没食子酸均能显著提高IVF胚胎的早期囊胚卵裂球数(P<0.05);但囊胚卵裂球凋亡率与对照组无显著差异(P>0.05);对卵母细胞内活性氧和总谷胱甘肽含量检测时,发现30μmol/L没食子酸可显著降低细胞内活性氧水平(P<0.05),且显著提高总谷胱甘肽含量(P<0.05)。综上所述,在黄牛卵母细胞体外成熟液中添加适量的没食子酸能有效降低卵母细胞内活性氧水平,提高总谷胱甘肽含量,进而提高卵母细胞成熟的质量及其后续IVF胚胎发育能力。
- 黄永军李小凤文冬梅佘春邓凯潘尔科邵齐明石德顺韦英明陆凤花
- 关键词：没食子酸体外受精
- 水牛bbu-miR-103-1在泌乳期与非泌乳期表达模式及靶向基因的初步研究被引量：2
- 2016年
- 旨在探讨bbu-miR-103-1在水牛泌乳期和非泌乳期的差异表达模式,并预测其靶向调控基因及功能。本研究应用qRT-PCR检测bbu-miR-103-1,在水牛泌乳期和非泌乳期的差异表达。构建bbu-miR-103-1前体表达质粒LpEZX-pre-miR-103-1,并在293T细胞中包装高滴度的慢病毒颗粒,用于感染水牛乳腺上皮细胞实现过表达bbu-miR-103-1,同时应用化学合成的bbu-miR-103-1抑制剂转染水牛上皮细胞实现抑制表达bbu-miR-103-1,研究bbu-miR-103-1对PANK3及乳脂代谢相关基因表达的影响。结果表明,水牛泌乳期bbu-miR-103-1的相对表达量为非泌乳期的5.29倍(P<0.01);成功构建的慢病毒载体LpEZX-pre-miR-103-1包装获得了感染滴度为3.47×106PFU·mL-1的慢病毒颗粒;过表达和抑制表达bbu-miR-103-1分别极显著下调和上调了水牛乳腺上皮细胞PANK3基因的相对表达量(P<0.01);过表达bbu-miR-103-1极显著提高了ACACA、GPAM、DGAT1和PDK4基因的表达(P<0.01),对SREBP1c、ADFP、CD36、ACSS1等基因产生了显著的上调作用(P<0.05)。过表达bbu-miR-103-1通过下调PANK3的表达,反馈提高了SREBP1c的mRNA水平,促进了以ACACA开头的脂肪酸从头合成。表明bbu-miR-103-1对水牛乳脂肪合成有十分重要的促进作用,为揭示水牛高乳脂形成和调控机理提供了分子依据。
- 蔡小艳李胜陈秋萍王萍邓凯刘庆友石德顺
- 关键词：水牛
- 水牛卵母细胞成熟过程中卵丘细胞差异基因表达的研究
- 引言/目的研究发现,人、小鼠、牛等动物卵母细胞在成熟的过程中,对应的卵丘细胞中差异显著的基因可以作为标记基因预测卵母细胞的发育能力,而在水牛上的研究还未见报道。本研究利用荧光定量PCR方法检测水牛卵母细胞体外成熟培养前后...
- 沈朋雷郭振伟秦希玲邓凯邓彦飞蒋建荣陆凤花石德顺
