杜姗姗
- 作品数：8 被引量：15H指数：2
- 供职机构：广西大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划广西省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 水牛asf1a基因克隆及高效敲除靶位点的筛选被引量：1
- 2019年
- 本研究旨在对水牛anti-silence factor 1a (asf1a)基因进行克隆并行生物信息学分析,并进一步筛选基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的高效敲除asf1a基因位点。根据NCBI公布的牛asf1a基因mRNA序列设计特异性引物,以水牛GV期卵母细胞RNA反转录后的cDNA作为模板,通过PCR技术克隆获得asf1a基因序列片段,利用生物信息学分析方法,对克隆得到的序列进行和相应翻译的蛋白质进行了分析。在克隆得到的水牛asf1a基因序列上筛选3个PAM位点,并根据PAM位点构建3个gRNA载体(g1、g2、g3)以及相应的RGS载体,将pcDNA3.1-h Cas9连同gRNA、RGS 3种质粒按照3∶1∶1比例共转293T细胞,筛选高效的CRISPR/Cas9敲除位点。试验以水牛GV期的卵母细胞RNA作为模板,通过RT-PCR技术克隆获得asf1a基因序列,并据测序结果设计靶向区域筛选高效asf1a基因敲除位点。结果发现,水牛asf1a基因CDS区全长615 bp,编码204个氨基酸;多重序列分析显示,水牛asf1a基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%,98%,97%,96%,93%;蛋白质结构预测分析发现存在ASF1-hist-chap等结构,二级结构含有9个α螺旋、12个β折叠、14个T转角、14个无规则卷曲。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最接近。根据水牛asf1a设计的敲除载体转染293T和成纤维细胞后,细胞基因组进行T7E1酶切的结果表明,g1位点对水牛成纤维细胞敲除效率最高,达到93.82%,同时,sanger测序表明效率达17/20。本研究成功克隆了水牛asf1a基因和分析了其生物学信息,同时筛选出了asf1a的高效敲除位点,为研究水牛asf1a基因功能奠定基础。
- 刘晓华邓凯范威宏黄永军杜姗姗冯万有潘尔科卢嘉卡文冬梅陆凤花石德顺
- 关键词：水牛克隆
- C型利钠肽及其受体在水牛卵泡中的表达分析被引量：1
- 2016年
- 为了探明C型利钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)及其受体(natriuretic peptide receptor,NPR)在水牛卵泡中的表达模式,本研究首先采用实时荧光定量PCR技术检测水牛卵巢中利钠肽家族主要成员A型、B型、C型利钠肽(ANP、BNP、CNP)及其Ⅰ型、Ⅱ型受体(NPR1、NPR2)的mRNA表达情况,然后利用免疫组化技术对水牛卵泡中CNP及NPR2蛋白进行定位,最后利用实时荧光定量PCR技术检测颗粒细胞和卵丘细胞中CNP及NPR2的mRNA表达规律。结果显示,水牛卵巢主要表达CNP及NPR2,且在各级卵泡中均有表达,其中,CNP主要在壁层颗粒细胞中表达,NPR2主要在卵丘细胞中表达;颗粒细胞上CNP mRNA表达水平显著高于卵母细胞周围的卵丘细胞(P<0.05),而卵丘细胞上NPR2mRNA表达水平显著高于颗粒细胞(P<0.05)。综上所述,在利钠肽主要家族成员和受体中,CNP和NPR2在水牛卵巢中呈现强表达,CNP主要在壁层颗粒细胞中表达,而NPR2主要在卵母细胞周围的卵丘细胞中表达。
- 周文婷孙龙飞尹娜杜姗姗赵鑫代小丽陆凤花石德顺
- 关键词：C型利钠肽
- 水牛卵母细胞GV/MⅡ期对应卵丘细胞miRNA差异表达分析被引量：6
- 2017年
- 本研究旨在建立水牛卵母细胞体外成熟培养前后GV/MⅡ(Germinal vesicle,GV)/(MetaphaseⅡ,MⅡ)期对应的卵丘细胞miRNA数据库,筛选两个时期差异表达的miRNAs,为进一步阐明miRNA通过调控卵丘细胞中基因表达进而在卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用提供科学依据。分别收集水牛GV/MⅡ期的卵丘细胞,提取总RNA,利用Solexa测序技术获取小RNA测序数据,并进行生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了GV/MⅡ期卵丘细胞miRNA的表达谱,发现相对于GV期卵丘细胞,miRNA在MⅡ期卵丘细胞中表达差异显著上调的有24个,表达差异显著下调的有45个。采用qRT-PCR技术对随机筛选的8个miRNAs进行验证,证实其表达水平和RNA-seq分析结果相一致。结合靶基因预测和KEGG富集分析,获得了276条显著富集的信号通路;同时对富集前20的信号通路进行归纳总结,推测差异表达的miRNAs主要是通过细胞增殖、凋亡,物质代谢,细胞连接等途径在卵丘细胞中发挥作用。
- 沈朋雷秦希玲尹倩郭振伟邓凯杜姗姗尹娜阮子芸石德顺陆凤花
- 关键词：水牛卵丘细胞MIRNAS
- FGF10在水牛卵泡发育中的表达模式及其对水牛卵母细胞体外成熟的影响
- 卵母细胞的体内成熟是在卵泡的微环境中完成，而卵母细胞的体外成熟则缺少这样的生理环境，故其成熟率和发育潜能均低于体内成熟的卵母细胞。为此，许多研究者尝试改良体外成熟培养条件来改善卵母细胞的体外成熟效果。现已有报道证明FGF...
- 杜姗姗
- 关键词：水牛卵泡发育卵母细胞体外成熟
- 咖啡因对水牛卵母细胞成熟及体细胞核移植胚胎发育的影响
- MPF是调节细胞周期的一个非常重要的蛋白激酶,在卵母细胞减数分裂启动、GVBD发生、纺锤体形成、MⅡ期停滞的维持等方面均发挥重要作用.MPF的活性受Wee1、Myt1的调控.咖啡因是一种蛋白磷酸酶抑制剂,它能抑制Wee1...
- 杜姗姗刘晓华柯浩马玉洁王萍陆凤花石德顺
- 关键词：水牛卵母细胞体细胞核移植胚胎发育咖啡因
- 文献传递
- 线粒体移植对水牛卵母细胞发育潜能的影响被引量：4
- 2015年
- 本研究以水牛卵泡颗粒细胞作为线粒体的来源细胞,初步探讨水牛卵母细胞进行线粒体移植(MIT)后对其发育潜能的影响。试验比较了不同级别水牛卵母细胞mtDNA的拷贝数,并研究了水牛卵母细胞进行MIT后,其后续早期胚胎发育及胚胎线粒体膜电位(ΔΨm)的变化情况。结果显示:一级卵母细胞组的平均mtDNA拷贝数极显著高于二、三级卵母细胞组((202 101±74 432)vs(118 483±17 028),(39 177±7 938),P<0.01),二级卵母细胞组的平均mtDNA拷贝数极显著高于三级卵母细胞组((118 483±17 028)vs(39 177±7 938),P<0.01);孤雌激活处理后发现:一级卵母细胞组的卵裂率和囊胚率也都极显著高于二、三级卵母细胞组(P<0.01),而二级卵母细胞组激活后胚胎的卵裂率和囊胚率亦极显著高于三级卵母细胞组(P<0.01)。用Mito-Tracker探针标记的外源线粒体经移植后,会随着胚胎的发育而发生移动,分布到各个卵裂球中;且发现二级卵母细胞MIT组孤雌激活后的囊胚率显著高于对照组和空注组(27.3%vs 17.4%,7.84%,P<0.05),而三级卵母细胞MIT组激活后的囊胚率与对照组和空注组差异不显著(P>0.05);对胚胎ΔΨm检测发现,水牛植入前各时期胚胎ΔΨm总体呈上升趋势,线粒体移植后胚胎各时期的ΔΨm均显著高于对照组(P<0.05)。综上表明:不同质量的水牛卵母细胞其mtDNA拷贝数存在显著差异,且mtDNA拷贝数与卵母细胞质量和发育能力成正相关;通过移植外源线粒体可以提高二级水牛卵母细胞的发育潜能。
- 高亚可陆凤花吴柱连马帆刘晓华杜姗姗石德顺
- 关键词：线粒体膜电位水牛卵泡颗粒细胞
- 水牛FGF10基因的克隆分析及其在不同组织中表达情况的研究被引量：2
- 2016年
- 本实验旨在对水牛成纤维细胞生长因子10(FGF10)基因进行克隆、生物信息学分析,同时探讨其在不同组织中的表达模式。以水牛卵巢的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆得到FGF10基因CDS区全长642 bp,编码213个氨基酸。多重序列分析显示,水牛FGF10基因核苷酸序列与黄牛、羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%、99%、93%、91%和89%。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最近,并且在不同物种进化过程中具有高度保守性。QRT-PCR结果表明,FGF10在睾丸中的表达量最高,卵巢和脾脏次之,肝脏和心脏中最低。本研究成功克隆水牛FGF10基因,并检测其在水牛不同组织中的差异表达,为研究FGF10基因在水牛卵泡发育过程中的作用奠定基础。
- 杜姗姗周文婷高亚可邓凯刘晓华王萍陆凤花石德顺
- 关键词：水牛克隆
- 黄牛类胚胎干细胞的培养
- 本研究采用分离着床前囊胚的内细胞团的方法培养黄牛类胚胎干细胞,通过对分离胚胎内细胞团方法和控制饲养层密度以及传代方法的培养条件的实验摸索,得出以下结论:使用器械分离法分离出囊胚内细胞团,使其贴壁在密度为80％的饲养层生长...
- 马玉洁劳艳萍朱鹏阮秋燕雷钏杜姗姗王萍陆凤花石德顺
- 关键词：黄牛胚胎干细胞
- 文献传递
