宫晓倩
- 作品数：21 被引量：18H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院上海兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市自然科学基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- H1N1亚型猪流感病毒HA1基因原核表达及鉴定被引量：1
- 2015年
- 本研究利用RT-PCR技术扩增禽源H1N1亚型猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的HA1基因片段,将其连接至p Cold-TF载体上,菌液鉴定为阳性的克隆经测序验证正确后,提取质粒转化至高表达的表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导并大量表达目的蛋白。表达产物经过纯化及SDS-PAGE电泳分析,表明重组蛋白以可溶性形式在上清中大量表达,大小约90 k Da,且在15℃、0.8 mmol/L IPTG条件下诱导24 h表达效果最好。通过Ni柱纯化后,经Western blot分析表明重组表达的蛋白能与禽源H1N1亚型SIV阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。
- 阮宝阳王林宫晓倩汪秀会刘晓敏汪琪单同领李泽君刘芹防陈鸿军滕巧泱童光志于海
- 关键词：HA1基因原核表达可溶性抗原性
- 禽传染性支气管炎病毒拮抗JAK-STAT信号通路的研究
- 2023年
- 已有报道显示冠状病毒拮抗干扰素下游JAK-STAT信号通路,然而,关于传染性支气管炎病毒(IBV)对JAK-STAT信号通路的拮抗,鲜有报道。本文通过Western blot试验,证实IBV感染抑制STAT1和STAT2的磷酸化;间接免疫荧光实验证实IBV和nsp15核酸酶活性缺陷型重组病毒rIBV-nsp15-H238A均能抑制STAT1的核转位,说明IBV感染确实拮抗JAK-STAT信号通路,且nsp15核酸酶活性不是必需的。进一步实验证明,IBV编码的核酸内切酶nsp15,能够抑制内源性和外源性的STAT1表达,并且nsp15的核酸酶活性位点及其三聚化能力都是必需的。由于nsp15缺陷型毒株rIBV-nsp15-H238A能够跟野生型IBV一样拮抗JAK-STAT信号通路,推测IBV还编码其他蛋白,作用于JAK-STAT信号通路,需要进一步对病毒蛋白进行筛选和研究。
- 楚红燕宫晓倩徐丘璠仇旭升谭磊孙英杰刘炜玮宋翠萍钱琨丁铲廖瑛陈丽颖
- 关键词：传染性支气管炎病毒JAK-STAT信号通路
- 古典H1N1亚型猪流感病毒PB2 K627E突变对病毒复制能力的影响被引量：1
- 2016年
- 旨在探索古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)PB2K627E突变对病毒复制能力的影响。利用反向遗传操作技术和点突变技术成功获得古典H1N1亚型猪流感病毒的拯救株(627K)和突变株(627E)后,分别在MDCK细胞和小鼠体内对拯救株和突变株的复制能力进行比较。体外MDCK细胞试验结果显示,突变株与拯救株相比,细胞病变(CPE)减小、空斑形态减小、生长曲线差异极其显著,表明突变株在MDCK细胞上的复制能力减弱。小鼠攻毒试验结果表明,突变株对小鼠体重变化的影响不明显,在小鼠肺中的病毒滴度明显下降,引起病理损伤较轻。体外MDCK细胞及小鼠攻毒试验结果均表明,突变株与拯救株相比复制能力降低。该结果不仅证实了猪流感病毒PB2 627位氨基酸是一种重要的毒力分子标记,同时还为进一步阐明其致病机制提供了条件。
- 汪秀会宫晓倩阮宝阳刘晓敏汪琪张鹏李泽君周艳君童武郑浩童光志于海
- 猪流感病毒新型核糖体移码蛋白PA-X特有序列的原核表达、纯化及鉴定被引量：3
- 2016年
- 核糖体移码蛋白PA-X是流感病毒的一种新型蛋白,为了研究该蛋白对于猪流感病毒的生物学特性的影响,我们进行了PA-X特有序列的原核表达、蛋白纯化及其鉴定。通过RT-PCR和重叠PCR方法扩增PA-X特有序列的基因,利用基因重组技术构建原核表达载体,并进行菌液PCR和菌液测序鉴定,鉴定正确后克隆转化到BL21(DE3)中,进行蛋白表达及可溶性分析,同时用镍柱亲和层析法对其进行纯化。通过菌液PCR序列鉴定,PA-X特有序列的原核表达载体序列正确,编码框正确。转化BL21后目的蛋白表达成功,且大多数为可溶性蛋白。Western blot结果表明制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应性。
- 宫晓倩阮宝阳刘晓敏张鹏汪琪汪秀会周艳君李泽君童武郑浩童光志于海
- 关键词：猪流感病毒原核表达蛋白纯化BLOT
- 重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株，该重组疫苗株包含：欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因。本发明还公开了上述重组猪流...
- 于海童光志阮宝阳宫晓倩李泽君汪秀会刘晓敏
- 文献传递
- 欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：2
- 2016年
- 本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件：抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1：200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1：40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD450≤0.255和OD450≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制（haemagglutination inhibition,HI）检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD450值的批内变异系数为1.97%-7.85%,批间变异系数为1.94%-6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。
- 阮宝阳王林宫晓倩刘晓敏张鹏汪琪李泽君童光志于海
- 关键词：重组蛋白间接ELISA
- 禽源NA和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响
- 为探究禽源NA和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响,本研究通过对猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07(H1N2)与A/swine/Zhejiang/1/07(H1N1)进行测序以及基因型分析,确定了S12...
- 刘晓敏宫晓倩阮宝阳张鹏汪琪杨海明单同领童武李国新郑浩周艳君童光志于海
- 关键词：重组病毒
- 文献传递
- 细胞源与鸡胚源传染性支气管炎病毒激活JAK⁃STAT信号通路的差异性研究
- 2021年
- 鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)对鸡的呼吸道、肾脏和输卵管等器官造成严重损伤,主要引起鸡产蛋率下降和雏鸡死亡。目前通过鸡胚传代获得IBV疫苗株和流行毒株。IBV Beaudette株是目前实验室研究的经典毒株,已经适应人源和猴源细胞,可利用Vero细胞进行制备。有研究表明,IBV感染延迟干扰素的表达,并对JAK⁃STAT信号通路具有拮抗作用。本研究中发现,通过Vero细胞制备的IBV Beaudette株,在感染早期激活STAT1,通过鸡胚制备的IBV Beaudette,则不能有效激活STAT1。进一步研究发现,鸡胚传代的IBV QX株和新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)亦不能有效刺激JAK⁃STAT信号通路。两种制备病毒的方式分别得到不同的试验结果,推测是由于在病毒感染条件下,Vero细胞分泌到培养液中的细胞因子所致。进一步研究揭示,病毒感染条件下,细胞分泌的因子,瞬时激活了STAT1。本研究对于病毒的制备方式对天然免疫信号通路的影响,具有一定的参考和借鉴作用。
- 楚红燕宫晓倩翁文莲王欢方守国丁铲廖瑛陈丽颖
- 关键词：细胞上清
- 古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立被引量：2
- 2014年
- 利用RT-PCR技术扩增古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011株的8个目的基因片段,分别克隆至双向转录表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,48 h后收集上清,接种MDCK细胞。当细胞出现明显病变时,收集MDCK细胞上清,其血凝效价为1:64,与原始野生株血凝效价一致;提取拯救病毒的RNA并进行8个目的片段扩增及序列分析,测序结果显示与野生株病毒相同,表明病毒拯救成功。古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立,不仅为探索流感病毒致病机理、感染机制及功能研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研制开辟了新的途径。
- 汪秀会宫晓倩刘晓敏阮宝阳李泽君周艳君童光志于海
- 关键词：RT-PCRH1N1亚型猪流感病毒病毒拯救
- 重组H1N1亚型猪流感灭活疫苗的制备及免疫保护效力评价
- <正>猪流感(Swine Influenza,SI)是由猪流感病毒(Swine influenza Virus,SIV)引起的一种急性呼吸道疾病,临床症状以突发、高热、精神沉郁、食欲废绝、咳嗽、呼吸困难、反复发作、衰竭、...
- 于海阮宝阳汪琪刘晓敏汪秀会宫晓倩杨海明王帅勇单同领童武李国新童光志
- 文献传递
