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乙型脑炎病毒E264位点回复突变对疫苗安全性的影响被引量：1: 2018年; 目的通过反向遗传学技术,构建乙型脑炎病毒减毒疫苗株SA14-14-2囊膜蛋白(envelope protein,E蛋白)第264位氨基酸的回复突变株,并分析该位点突变对疫苗株小鼠毒力的影响。方法通过融合PCR扩增含基因组第1 769核苷酸位点回复突变的基因片段(T→G),替换SA14-14-2相应区域,使得编码E264位点的氨基酸位点由SA14-14-2的组氨酸(H)回复突变成强毒株SA14的谷氨酰胺(Q),将该回复突变株命名为r JEV264(H→Q),通过测定蚀斑大小和一步生长曲线,分析r JEV264的增殖特征;通过测定该突变株的昆明种小鼠脑内神经毒力、皮下感染入脑能力、腹腔感染入脑能力,分析E264位点回复突变后对小鼠毒力的影响。结果成功构建了回复突变株r JEV264,该突变株蚀斑大小与SA14-14-2相似,在PHK细胞上的增殖特征与SA14-14-2没有明显差异。r JEV264对小鼠有可检测的脑内神经毒力,毒力为5.51 lg PFU/LD50,但无论是皮下注射还是腹腔注射,都没有使小鼠发病。结论在分子水平证明了E264位点是影响乙脑减毒活疫苗安全性的关键位点之一,E264位点的回复突变增强了SA14-14-2的小鼠脑内神经毒力,但没有增强小鼠神经侵袭力。; 刘莉娜孙艳范凤鸣杨欢牟建超陈智刘俐刘杰曾献武杨会强; 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗回复突变神经毒力

乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的纯化: 2015年; 目的建立纯化乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的方法。方法应用超滤浓缩和分子筛凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2病毒液,检测其病毒滴度、原代地鼠肾细胞残留蛋白含量、牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量,并进行小鼠脑内致病力试验、乳鼠传代返祖试验、异常毒性试验,制备纯化冻干疫苗,进行热稳定性试验。结果纯化后的JEV病毒滴度高于7.0 lg PFU/ml,平均回收率为23%;牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量及安全性试验均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,去除了约95%的原代地鼠肾细胞残留蛋白;制备的冻干疫苗及热稳定性试验中的病毒滴度均高于5.7 lg PFU/ml,且热稳定性试验中病毒滴度下降未超过1.0 lg,符合《中国药典》三部(2010版)规定。结论建立了乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)纯化工艺,但病毒回收率较低,不适宜规模化生产,对乙型脑炎病毒减毒活疫苗质量控制具有指导意义。; 刘杰孙艳刘辉康庄毛川成刘莉娜陈智牟建超赵宇刘俐杨会强李玉华; 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗 SA14-14-2 纯化

病毒感染复数对狂犬病毒PM株增殖的影响被引量：6: 2016年; 目的：探讨不同感染复数（Multiplicity of infection,MOI）的狂犬病毒PM株在人二倍体细胞（2BS株）中增殖的影响,确定感染复数。方法将狂犬病毒PM株按照MOI 0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20接种至2BS细胞中,用显微镜观察接种病毒后细胞的形态变化；培养3-5d后,第一次收获病毒液；更换培养液继续培养3-4d后,进行第二次收获。采用小鼠脑内滴定法测定狂犬病毒滴度,通过NIH法测定灭活病毒液的效价。结果当MOI为0.05-0.10时,细胞圆缩30%-40%,细胞能维持较好的生长形态,可收获病毒,病毒收获液的滴度较高（〉5.0 lgLD50/mL）,且灭活后病毒液的效价较高（〉4.0IU/mL）。结论确定狂犬病毒PM株在人二倍体2BS细胞增殖的适宜MOI,为人用狂犬病疫苗生产工艺的优化提供了依据。; 陈智孙艳牟建超刘莉娜刘宇刘辉刘杰; 关键词：2BS细胞病毒滴度效价

寨卡病毒E蛋白第三结构域的可溶性表达及多克隆抗体的制备: 2019年; 目的原核表达并纯化寨卡病毒(Zika virus)E蛋白第三结构域(ZK-EⅢ)重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增ZK-E Ⅲ序列,经双酶切后将其插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-ZKE Ⅲ,转化至大肠埃希菌(E. coli)Rosetta2(DE3),经IPTG诱导,表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备ZK-E Ⅲ多克隆抗血清,进行Western blot鉴定后,ELISA法检测该抗血清效价。结果经PCR及测序鉴定证明原核表达质粒pET-ZKE Ⅲ构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约31 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的60%;用纯化的重组蛋白免疫家兔后,获得的血清特异性良好,血清效价为1∶51 200。结论 ZKE Ⅲ蛋白在E. coli中以可溶性形式表达,制备的抗血清特异性好,效价高,具有用于寨卡病毒诊断和进行重组亚单位疫苗开发的潜力。; 何婷杨欢范凤鸣刘杰牟建超孙艳陈智代云见曾献武杨会强; 关键词：原核表达多克隆抗体

乙型脑炎病毒E蛋白毒力关键位点的正向验证被引量：3: 2018年; 目的将乙型脑炎野毒株SA14囊膜蛋白(envelope,E)氨基酸残基107位点(E107)和138位点(E138)突变为乙型脑炎减毒株SA14-14-2的相应位点,正向分析两个氨基酸位点突变在乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)减毒中的作用。方法通过融合PCR方法分别扩增含有E107(1296-T)、E138(1389-A)、E107+138(1296-T/1389-A)突变位点的PCR片段,KasⅠ和BglⅡ酶切后替换乙型脑炎强毒SA14的嵌合病毒SA14-14-2/SA14的相应区域,构建3个突变株病毒的全长克隆,转染BHK21细胞获得突变株病毒。测定并比较3个突变株和嵌合病毒SA14-14-2/SA14、疫苗株SA14-14-2的蚀斑大小及细胞增殖特征、小鼠脑内神经毒力、小鼠皮下感染入脑能力,分析E107、E138位点突变对JEV的减毒作用。结果测序结果表明成功构建了3株突变株病毒,其中E107单位点突变对小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力无显著改变,蚀斑形态和细胞增殖能力也无明显变化。E138单位点突变及E138和E107双位点突变使病毒脑内神经毒力和皮下感染入脑能力急剧降低,其中E138和E107双位点突变使病毒皮下感染入脑能力完全消失,并且E138单位点突变以及E138和E107双位点突变病毒蚀斑较疫苗株SA14-14-2和嵌合病毒SA14-14-2/SA14明显偏小,但增殖能力有明显升高。结论 E138位点突变对JEV SA14的减毒起关键作用;在E138位点突变的前提下,E107位点与E138位点有显著的协同作用。; 范凤鸣刘莉娜孙艳牟建超陈智杨欢刘俐刘杰曾献武杨会强; 关键词：乙型脑炎病毒 E蛋白

乙脑/登革2型嵌合病毒的构建及其作为疫苗候选株的初步检定: 2018年; 目的构建以乙脑疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革2型嵌合病毒,并进行初步检定,分析其作为疫苗候选株的可行性。方法用登革病毒(dengue virus,DENV)减毒株PDK53 prME基因替换乙脑病毒疫苗株SA14-14-2的相应区域,构建乙脑/登革2型嵌合病毒全长克隆质粒,通过体外转录、转染原代地鼠肾(PHK)细胞,拯救出乙脑/登革2型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒的蚀斑特征、增殖特征、神经毒力和神经侵袭力、免疫原性及免疫攻击保护作用。结果构建的嵌合病毒比乙脑疫苗株SA14-14-2具有更小的蚀斑,在PHK细胞上具有更低的增殖能力;对成鼠无神经毒力和神经侵袭力;可诱导小鼠产生较高的中和抗体效价,且免疫8周后,中和抗体滴度无明显下降(P> 0. 05);能保护小鼠免受致死剂量DENV的脑内攻击。结论本实验制备的嵌合病毒具有良好的安全性、免疫原性及免疫保护作用,有望作为登革疫苗候选株。; 牟建超范凤鸣陈智冯劲松何婷杨欢杨会强曾献武刘杰; 关键词：乙型脑炎病毒登革病毒神经毒力免疫保护

狂犬病病毒PM株病毒滴度检测改良蚀斑法的建立: 2019年; 目的建立检测狂犬病病毒PM株病毒滴度的改良蚀斑法,并验证其精密度。方法于细胞接种病毒后第6天,分别加入不同浓度(0、50、75、100、200、400 mmol/L)HEPES溶液,以及分别于细胞接种病毒后第2、4、6、8天,加入最适浓度的HEPES溶液,确定HEPES最适加入浓度及蚀斑最适判定时间,建立改良的蚀斑法,检测48批狂犬病病毒毒力,并与小鼠脑内滴定法进行相关性比较;重复检测3次10批狂犬病病毒收获液毒力,计算变异系数(CV)。结果接种病毒后第6天后加入200 mmol/L HEPES溶液,形成的蚀斑清晰,易于计数。建立的蚀斑法与小鼠脑内滴定法具有高度相关性,3次检测结果的CV在0. 4%～3. 38%之间,重复性良好。结论加入HEPES溶液改良后的蚀斑法,操作便捷,是较为理想的滴定狂犬病病毒PM株毒力的方法,可替代小鼠脑内滴定法。; 孙艳陈智钟静刘莉娜何敏范凤鸣杨欢曾献武刘杰; 关键词：蚀斑法

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陈智

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