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乙型脑炎病毒E蛋白毒力关键位点的正向验证被引量：3: 2018年; 目的将乙型脑炎野毒株SA14囊膜蛋白(envelope,E)氨基酸残基107位点(E107)和138位点(E138)突变为乙型脑炎减毒株SA14-14-2的相应位点,正向分析两个氨基酸位点突变在乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)减毒中的作用。方法通过融合PCR方法分别扩增含有E107(1296-T)、E138(1389-A)、E107+138(1296-T/1389-A)突变位点的PCR片段,KasⅠ和BglⅡ酶切后替换乙型脑炎强毒SA14的嵌合病毒SA14-14-2/SA14的相应区域,构建3个突变株病毒的全长克隆,转染BHK21细胞获得突变株病毒。测定并比较3个突变株和嵌合病毒SA14-14-2/SA14、疫苗株SA14-14-2的蚀斑大小及细胞增殖特征、小鼠脑内神经毒力、小鼠皮下感染入脑能力,分析E107、E138位点突变对JEV的减毒作用。结果测序结果表明成功构建了3株突变株病毒,其中E107单位点突变对小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力无显著改变,蚀斑形态和细胞增殖能力也无明显变化。E138单位点突变及E138和E107双位点突变使病毒脑内神经毒力和皮下感染入脑能力急剧降低,其中E138和E107双位点突变使病毒皮下感染入脑能力完全消失,并且E138单位点突变以及E138和E107双位点突变病毒蚀斑较疫苗株SA14-14-2和嵌合病毒SA14-14-2/SA14明显偏小,但增殖能力有明显升高。结论 E138位点突变对JEV SA14的减毒起关键作用;在E138位点突变的前提下,E107位点与E138位点有显著的协同作用。; 范凤鸣刘莉娜孙艳牟建超陈智杨欢刘俐刘杰曾献武杨会强; 关键词：乙型脑炎病毒 E蛋白

一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用: 本发明公开了一种乙脑/黄热嵌合病毒的cDNA克隆，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明还公开了乙脑/黄热嵌合病毒及其应用，以及一种预防黄热病的疫苗。本发明嵌合病毒Chimeri-JYF的毒性小，免疫保护作用好...; 杨会强汪伟何婷刘莉娜赵宇刘俐曾献武

病毒感染复数对狂犬病毒PM株增殖的影响被引量：6: 2016年; 目的：探讨不同感染复数（Multiplicity of infection,MOI）的狂犬病毒PM株在人二倍体细胞（2BS株）中增殖的影响,确定感染复数。方法将狂犬病毒PM株按照MOI 0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20接种至2BS细胞中,用显微镜观察接种病毒后细胞的形态变化；培养3-5d后,第一次收获病毒液；更换培养液继续培养3-4d后,进行第二次收获。采用小鼠脑内滴定法测定狂犬病毒滴度,通过NIH法测定灭活病毒液的效价。结果当MOI为0.05-0.10时,细胞圆缩30%-40%,细胞能维持较好的生长形态,可收获病毒,病毒收获液的滴度较高（〉5.0 lgLD50/mL）,且灭活后病毒液的效价较高（〉4.0IU/mL）。结论确定狂犬病毒PM株在人二倍体2BS细胞增殖的适宜MOI,为人用狂犬病疫苗生产工艺的优化提供了依据。; 陈智孙艳牟建超刘莉娜刘宇刘辉刘杰; 关键词：2BS细胞病毒滴度效价

登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备被引量：1: 2013年; 目的构建登革病毒1型(DENV-1)E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应(PCR)扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta(DE3)感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。; 汪伟丁显平杨会强李竹石谭帅赵宇刘莉娜谭昌耀曾献武; 关键词：登革病毒原核细胞

乙脑/登革4型嵌合病毒的构建及其小鼠神经毒力测定: 2019年; 目的构建以乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革4型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒对小鼠的神经毒力。方法通过重叠PCR方法扩增含有登革病毒4型(DENV-4)H241株pr ME基因序列和乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的NS1蛋白前177个核苷酸的融合片段,用Nar I和Bgl II双酶切后替换乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2全长克隆中的相应区域,构建成乙脑/登革4型嵌合全长克隆,通过体外转录和转染BHK21细胞获得嵌合病毒(JEV/DENV-4 chimeric virus,JD4)。通过测定嵌合病毒JD4和2个母本株JEV SA14-14-2株及DENV-4 H241株蚀斑大小、小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力、乳鼠脑内神经毒力,比较JD4和母本株之间的差异。通过将JD4在原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞传代30次,分析传代后嵌合病毒的神经毒力是否减弱及减弱的程度。结果测序结果表明,构建的嵌合病毒JD4基因组序列和预期一致,没有产生新的位点突变。JD4蚀斑较SA14-14-2明显偏小,但和DENV-4 H241株没有明显区别。JD4对3周龄小鼠具有较强的脑内神经毒力,和母本株DENV-4 H241没有差异,对小鼠没有神经侵袭力。乳鼠实验结果表明,嵌合病毒JD4脑内神经毒力虽然略低于母本株DENV-4 H241,但两者之间没有明显差异,都明显强于乙脑疫苗株SA14-14-2。在PHK细胞传代30次后,小鼠神经毒力虽然有所减低,但并不明显。结论成功构建了嵌合病毒JD4,通过测定并比较JD4与母本株的蚀斑特征、小鼠及乳鼠神经毒力等试验,为分析登革疫苗候选株安全性研究奠定了基础。; 孙艳汪伟刘莉娜范凤鸣杨会强刘杰曾献武; 关键词：神经毒力

乙型脑炎减毒活疫苗病毒群体的异质性分析被引量：2: 2015年; 目的通过观察疫苗病毒群体中病毒个体的遗传和生物学特征，分析SA14-14—2株乙型脑炎减毒活疫苗病毒的均一性，为疫苗病毒的遗传稳定性提供实验证据。方法对3批疫苗病毒连续进行3次蚀斑纯化后，各挑选8个蚀斑纯化株，扩大培养一代。比较24个病毒纯化株的包膜（envelope，E）蛋白基因序列、单斑培养病毒滴度以及蚀斑特征。结果24个纯化株中共有6个病毒株（25％）的E蛋白核苷酸发生变化，其中2株（8．3％）的核苷酸变异导致其编码氨基酸发生改变，这些变异占总核苷酸变异数的28．6％。动物实验表明，这2个纯化株没有引起小鼠神经毒力变化。在所有24个纯化株中，我国2010年版药典规定的影响疫苗病毒遗传稳定性的8个E蛋白关键位点的氨基酸均未发生改变。24个纯化株病毒的蚀斑大小和形态以及单斑培养滴度均无明显差异。结论疫苗病毒具有典型的准种群体多样性特征，但在群体病毒中未检测到E蛋白氨基酸位点为野生型病毒位点的个体病毒，因此，疫苗病毒具有很好的减毒群体特征和遗传稳定性。; 杨会强汪伟刘莉娜何婷曾献武; 关键词：脑炎病毒遗传异质性

乙型脑炎病毒E264位点回复突变对疫苗安全性的影响被引量：1: 2018年; 目的通过反向遗传学技术,构建乙型脑炎病毒减毒疫苗株SA14-14-2囊膜蛋白(envelope protein,E蛋白)第264位氨基酸的回复突变株,并分析该位点突变对疫苗株小鼠毒力的影响。方法通过融合PCR扩增含基因组第1 769核苷酸位点回复突变的基因片段(T→G),替换SA14-14-2相应区域,使得编码E264位点的氨基酸位点由SA14-14-2的组氨酸(H)回复突变成强毒株SA14的谷氨酰胺(Q),将该回复突变株命名为r JEV264(H→Q),通过测定蚀斑大小和一步生长曲线,分析r JEV264的增殖特征;通过测定该突变株的昆明种小鼠脑内神经毒力、皮下感染入脑能力、腹腔感染入脑能力,分析E264位点回复突变后对小鼠毒力的影响。结果成功构建了回复突变株r JEV264,该突变株蚀斑大小与SA14-14-2相似,在PHK细胞上的增殖特征与SA14-14-2没有明显差异。r JEV264对小鼠有可检测的脑内神经毒力,毒力为5.51 lg PFU/LD50,但无论是皮下注射还是腹腔注射,都没有使小鼠发病。结论在分子水平证明了E264位点是影响乙脑减毒活疫苗安全性的关键位点之一,E264位点的回复突变增强了SA14-14-2的小鼠脑内神经毒力,但没有增强小鼠神经侵袭力。; 刘莉娜孙艳范凤鸣杨欢牟建超陈智刘俐刘杰曾献武杨会强; 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗回复突变神经毒力

乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的纯化: 2015年; 目的建立纯化乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的方法。方法应用超滤浓缩和分子筛凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2病毒液,检测其病毒滴度、原代地鼠肾细胞残留蛋白含量、牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量,并进行小鼠脑内致病力试验、乳鼠传代返祖试验、异常毒性试验,制备纯化冻干疫苗,进行热稳定性试验。结果纯化后的JEV病毒滴度高于7.0 lg PFU/ml,平均回收率为23%;牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量及安全性试验均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,去除了约95%的原代地鼠肾细胞残留蛋白;制备的冻干疫苗及热稳定性试验中的病毒滴度均高于5.7 lg PFU/ml,且热稳定性试验中病毒滴度下降未超过1.0 lg,符合《中国药典》三部(2010版)规定。结论建立了乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)纯化工艺,但病毒回收率较低,不适宜规模化生产,对乙型脑炎病毒减毒活疫苗质量控制具有指导意义。; 刘杰孙艳刘辉康庄毛川成刘莉娜陈智牟建超赵宇刘俐杨会强李玉华; 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗 SA14-14-2 纯化

一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用: 本发明公开了一种乙脑/黄热嵌合病毒的cDNA克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了乙脑/黄热嵌合病毒及其应用，以及一种预防黄热病的疫苗。本发明嵌合病毒Chimeri‑JYF的毒性小，免疫保护作用好...; 杨会强汪伟何婷刘莉娜赵宇刘俐曾献武; 文献传递

无小鼠神经毒力的乙型脑炎病毒／登革病毒1型嵌合病毒的筛选与序列分析: 2018年; 目的采用蚀斑纯化法筛选对小鼠无神经毒力的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）／登革病毒（denguevirus，DENV）1型嵌合病毒（JD1）纯化株，分析影响JD1小鼠神经毒力的相关位点。方法将JD1在乳地鼠。肾细胞中进行3轮蚀斑纯化，检测JD1纯化株对小鼠的脑内神经毒力。然后提取无神经毒力纯化株的基因组RNA，用逆转录PCR分段扩增全基因组序列并进行序列测定。将测序结果分别与原DENV-1的前膜-包膜蛋白和JEV骨架病毒株SA-14-14-2的基因序列进行比对。选取2个无神经毒力纯化株进行小鼠免疫保护实验。采用单侧￡检验对结果进行比较。结果经过3轮蚀斑纯化后，获得大、中、小3种蚀斑形态的6个JD1纯化株。3个纯化株对小鼠无神经毒力，小鼠脑内注射后全部存活；1株神经毒力较弱，70％以上小鼠存活；2株具有强神经毒力，小鼠全部死亡。测序结果显示，对小鼠无神经毒力的3个纯化株存在2处相同的氨基酸突变。将其中2个纯化株JD1-PP-61和JD1-PP-31腹腔免疫小鼠后，再用1000半数致死量DENV-1鼠脑适应株进行脑内攻击。JD1-PP-61能较好地保护小鼠抵抗病毒攻击，仅20．0％小鼠死亡（t=7．237，P〈0．001）；JD1-PP-31保护效果稍弱，41．9％小鼠死亡（t=4．752，P〈0．01）。结论通过蚀斑纯化筛选出对小鼠无神经毒力的JD1纯化株，并发现了可能与神经毒力减弱相关的位点。; 何婷范凤鸣牟建超杨欢刘莉娜刘俐汪伟曾献武杨会强; 关键词：登革热病毒脑炎病毒神经毒力

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刘莉娜

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