孔佳慧
- 作品数：15 被引量：54H指数：4
- 供职机构：天津市眼科医院更多>>
- 发文基金：天津市科技计划天津市应用基础与前沿技术研究计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 慢病毒载体介导色素上皮衍生因子基因转染人脐带间充质干细胞研究
- 2017年
- 目的构建携带色素上皮衍生因子（PEDF）基因的慢病毒（LV）载体并转染人脐带间充质干细胞（hUCMSCs），初步探讨基因修饰PEDF-间充质干细胞的可行性。方法采用基因重组方法构建LV-PEDF载体，测定其LV滴度，以感染复数（MOI）值为10、30、50 的LV体外转染hUCMSCs，并据此分为相应MOI值实验组；以不含PEDF基因的相同MOI值的重组LV载体[LV-绿色荧光蛋白（GFP）]转染hUCMSCs，并据此分为 相应MOI值对照组。荧光显微镜观察两组细胞转染效率并计算转染率。采用细胞免疫荧光法、免疫细胞化学法、实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测50MOI实验组、50MOI对照组细胞中PEDF、血管内皮生长因子（VEGF） 表达水平。结果经酶切以及基因测序鉴定证明LV载体构建成功。转染96 h后，50MOI实验组细胞可见大量GFP表达，转染效率为72.1%。荧光显微镜观察发现，转染后96 h，50MOI实验组细胞胞浆PEDF、VEGF表达增强。光学显微镜观察发现，转染后96 h，50MOI实验组细胞胞浆PEDF表达较低，而VEGF表达较强。RT-PCR检测结果发现，50MOI实验组、50MOI对照组细胞中PEDF mRNA相对表达量分别为0.170±0.028、0.015±0.007；VEGF mRNA相对表达量分别为0.265±0.022、0.285±0.049。两组细胞中PEDF mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（F=70.29，P＜0.001）；VEGF mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（F=9.57，P＞0.05）。结论成功构建携带PEDF基因LV表达载体，并在hUCMSCs中过表达PEDF基因。
- 段红涛陈松董蒙王月欣孔佳慧宋建李泽东王继明
- 关键词：血管内皮生长因子类间充质干细胞慢病毒感染
- 人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究被引量：4
- 2015年
- 目的研究人脐带分离的间充质干细胞(UC-MSC)在体外分离、培养、扩增和鉴定以及向神经干细胞和神经元细胞分化的可能性,为临床治疗糖尿病视网膜病变(DR)神经损伤提供理论基础。方法选用足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带,剔除动静脉后采用贴壁法分离得到UC-MSC,选用20%FBS血清培养液进行原代培养,经传代培养、流式细胞检测后,用神经分化培养基诱导UC-MSC分别向神经干细胞和神经元细胞分化,在荧光显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光和RT-PCR方法进行鉴定。结果 UC-MSC呈贴壁生长,倒置显微镜可见细胞呈形态相对均一的梭形细胞,呈放射状排列生长或旋涡状生长。流式细胞检测表明这些细胞表达CD105(SH2)、CD73(SH3)及CD90等MSC标志物;不表达CD34、CD45、CD11b和CD19。经神经干细胞分化诱导后,细胞开始聚集形成大小不等的细胞簇形成悬浮的细胞团;RT-PCR及免疫荧光检测表明,其NSE和Neuro D1阳性细胞分别达(87.3±14.7)%、(72.6±11.8)%。经神经元细胞分化诱导后,细胞呈神经元样的突起,细胞胞体饱满、折光性明显变强;RT-PCR及免疫荧光检测表明,其MAP2和NF-M阳性细胞分别达(43.1±10.3)%、(69.4±19.5)%。结论在一定的诱导条件下,UC-MSC能向神经细胞分化,可能作为DR神经损伤的细胞移植治疗来源。
- 张惟陈松王继明段红涛孔佳慧王月欣董蒙毕雪宋建
- 关键词：脐带间充质干细胞神经干细胞神经元糖尿病视网膜病变
- 干性年龄相关性黄斑变性微扫视眼球运动特征观察被引量：1
- 2015年
- 目的 观察干性年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）微扫视眼球运动的特点,初步探讨高速眼球运动系统对黄斑疾病视功能评估和量化的价值.方法 前瞻性病例对照研究.收集2013年1～10月在天津市眼科医院就诊的单眼发病的干性AMD患者20例（20只眼）为A1组,对侧眼20只为A2组和视力正常的老年受试者20名主导眼20只眼为N1组,非主导眼20只眼为N2组.采用高速眼球运动记录系统分别对受试者双眼注视性眼球运动进行记录,运用Matlab程序对每组微扫视眼球运动成分进行识别和分析.比较不同组间微扫视幅度与峰值速度之间的差异,及不同组内微扫视幅度与峰值速度、LogMAR视力的相关性.结果 A1组（0.93±0.26）°/微扫视幅度显著高于A2组、N1组和N2组,差异具有统计学意义（F =4.51,P＜0.01）,A1组（95.00±19.57）°/s峰值速度也较A2组、N1组和N2组显著增加,差异具有统计学意义（F =4.68,P＜0.01）,相关分析结果显示,A1组微扫视幅度与峰值速度、LogMAR视力均差异有统计学意义（r=0.785、0.579,P＜0.01）.结论 微扫视幅度、峰值速度等可作为干性AMD患者眼球运动功能客观评价的指标。
- 李泽东史学锋陈松王昀段红涛宋健孔佳慧王月欣董蒙
- 关键词：黄斑变性眼球运动
- 玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞对糖尿病大鼠视网膜功能的保护作用
- 陈松孔佳慧
- PEDF基因修饰人脐带间充质干细胞对糖尿病大鼠视网膜的保护作用被引量：5
- 2017年
- 目的 探讨色素上皮衍生因子（PEDF）基因修饰的人脐带间充质干细胞（hUCMSC）对糖尿病视网膜病变（DR）大鼠视网膜的保护作用.方法 实验研究.采用慢病毒包装的PEDF-MSC-绿色荧光蛋白（GFP）质粒和GFP-间充质干细胞（MSC）质粒转染hUCMSC,并测量PEDF及VEGF的表达.成年SD大鼠50只采用随机数字表法随机分为5个组：正常对照组（A组）、DR对照组（B组）、磷酸盐缓冲液（PBS）治疗组（C组）、GFP-MSC治疗组（D组）及PEDF-MSC治疗组（E组）,各组均为10只大鼠.选取链脲佐菌素（STZ）腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型,造模成功后4个月进行干预治疗,D组与E组分别给予玻璃体腔注射GFP-MSC和PEDF-MSC,C组给予玻璃体腔注射PBS,A组与B组不予特殊治疗.干预后8周行HE染色观察视网膜内丛状层、内核层及外核层,并进行厚度测量,免疫组织化学染色观察视网膜PEDF和VEGF阳性染色情况,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测大鼠视网膜PEDF和VEGF mRNA的表达变化.计量数据均符合正态分布.两组数据间比较采用独立样本t检验;组间的数据采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,两个变量之间相关性分析采用Pearson相关性检验.结果 胰蛋白酶消化法获取的hUCMSC表达CD105、CD73和CD90,不表达CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR.ELISA检测结果显示,PEDF-MSC-GFP的PEDF（84.09±7.07） μg/L较GFP-MSC （9.03±0.14） μg/L表达增高,差异均有统计学意义（P〈0.05）,而VEGF表达差异无统计学意义（P〉0.05）.视网膜厚度测量分析结果显示：玻璃体腔注射后2个月,E组内丛状层厚度显著下降,内核层与外核层厚度显著增加（P〈0.05）.玻璃体腔注射后2周,荧光显微镜下观察到D组与E组大鼠玻璃体腔内放射状及簇状排列的绿色荧光,视网膜中未发现明显绿色荧光.免疫组织化学法染色结果显示：治疗后2个月,E组PEDF平均A值增加;VEGF平均A值下�
- 张惟段红涛陈松王月欣孔佳慧董蒙毕雪宋建
- 关键词：神经生长因子类舍平类血管内皮生长因子A玻璃体内注射
- 神经干细胞玻璃体腔移植对糖尿病大鼠视网膜功能及结构的影响被引量：3
- 2016年
- 目的 观察玻璃体腔注射人脐带间充质干细胞（hUCMSC）体外诱导的神经干细胞（NSC）对糖尿病大鼠视网膜功能及结构的影响。方法 健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，随机分为正常对照组（A组）、糖尿病组，分别为9、31只。糖尿病组大鼠经腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型。成模10周时，将建模成功的27只大鼠随机分为糖尿病对照组（B组）、玻璃体腔注射磷酸盐缓冲液组（C组）、玻璃体腔注射NSC组（D组），各组均为9只大鼠。A、B组不进行干预。干预后2、4、6周A^D组大鼠均行闪光视网膜电图检查，暗适应条件下记录暗适应视杆细胞反应（Rod-R）b波潜伏期和振幅以及最大混合反应（Max-R）a、b波潜伏期和振幅、振荡电位（OPs）总振幅。苏木精-伊红染色观察各组大鼠视网膜形态结构变化。结果 干预后2、4周，A～D组大鼠暗适应Rod-R b波振幅、Max-R a、b波潜伏期及振幅、OPs总振幅比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；D组暗适应Rod-R b波振幅、Max-R b波振幅、OPs总振幅较B、C组提高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Max-R b波潜伏期较B、C组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预后6周，D组暗适应Rod-R b波振幅、Max-R a、b波振幅、OPs总振幅较B、C组提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组Rod-R、Max-R b波潜伏期较C组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。建模后10周，与A组比较，糖尿病组大鼠视网膜各层细胞排列紊乱。干预后2周，与A组比较，B、C组视网膜各层细胞排列紊乱，内界膜连续性破坏，局部增厚；4周，D组视网膜各层细胞排列紊乱，视网膜神经节细胞数量较B、C组增多，血管扩张不明显。结论 玻璃体腔注射hUCMSC体外诱导的NSC对糖尿病大鼠视网膜功能及结构均有改善作用。
- 姜鉴洪孔佳慧陈松段红涛王月欣董蒙张惟王昀林锦镛
- 关键词：动物实验
- 糖尿病大鼠血-视网膜屏障功能评估中伊文思蓝灌注视网膜铺片技术的改良和应用被引量：4
- 2015年
- 背景 伊文思蓝（EB）灌注的大鼠视网膜铺片是实验研究过程中观察血-视网膜屏障（BRB）功能的常用方法,但以往视网膜标本经固定液处理后透光性差,仅能用激光扫描共焦显微镜进行观察,对实验设备要求较高. 目的 探讨EB灌注糖尿病（DM）大鼠视网膜后在PBS中制作透明视网膜标本,并用普通荧光显微镜观察BRB功能技术的可行性. 方法 应用随机数字表法将40只SD大鼠随机分为对照组、DM1个月组、DM 3个月组和DM 6个月组.将质量分数2％链脲佐菌素（STZ）溶于0.05 mmol/L枸橼酸缓冲液,以60 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射建立大鼠DM模型,对照组大鼠腹腔内注射等容量枸橼酸缓冲液.分别于造模后1、3、6个月按45 mg/kg的剂量经大鼠股静脉注射30 g/L的EB溶液,注射后15 min摘除双侧眼球,立即置于PBS中完整剥离视网膜,将视网膜放射状切开并平铺于载玻片上,避光晾至完全透明,封片,置于荧光显微镜下观察并拍照.应用IPP6.0软件分析图像,测量EB渗漏区面积与视网膜面积的百分比. 结果 对照组大鼠视网膜血管形态和走行正常,EB在波长546 nm激发光下呈红色荧光,均匀充盈于血管腔.DM 1个月组大鼠视网膜背景荧光较对照组大鼠略增强;DM 3个月组大鼠视网膜背景荧光进一步增强,视网膜血管呈现节段性扩张,可见明显的红色高荧光区;DM 6个月组大鼠视网膜血管粗细不均,部分走行迂曲,可见片状低灌注区及大量高荧光区.对照组、DM 1个月组、DM 3个月组和DM 6个月组EB渗漏区面积百分比分别为（0.05±0.02）％、（0.27±0.06）％、（1.17±0.1 8）％和（4.77±0.66）％,总体比较差异有统计学意义（F=795.800,P＜0.001）,其中DM 3个月组和DM 6个月组大鼠视网膜EB渗漏区面积百分比值明湿高于对照组,差异均有统计学意义（q＆#39;=10.338、43.475,均P＜0.001）. 结论 改良的EB灌注视网膜铺片技术操作简单,普通荧光显
- 董蒙陈松段红涛王月欣孔佳慧李泽东王昀
- 关键词：视网膜铺片糖尿病视网膜病变SPRAGUE-DAWLEY大鼠血-视网膜屏障伊文思蓝
- 不同病程糖尿病增殖型视网膜病变危险因素对比研究被引量：19
- 2015年
- 目的对比分析不同病程2型糖尿病（DM）并发严重增殖型糖尿病视网膜病变（PDR）的全身危险因素及眼部生物学结构。方法临床病例对照研究。回顾性分析2010年3月至2014年5月在天津市眼科医院就诊的186例严重PDR患者住院资料，按DM病程分为两组，A组：DM病程〈10年，B组：DM病程≥10年，采用f检验、x2检验统计学方法分析两组患者全身资料、实验室检查结果之间的差异；同时以100例无明显DR的2型DM患者（C组）的临床资料进行对比，采用单因素方差分析PDR患者眼轴、前房深度、晶状体厚度的变化。将P〈0．05的指标纳入多因素Logistic回归分析。结果186例PDR患者中，男性96例（51．6％），女性90例（48．4％）；A组61例（32．8％），B组125例（67．2％），两组患者全身因素比较年龄、DM发病年龄、空腹血糖、餐后2h血糖、血糖波动值、胰岛素使用差异有统计学意义（P〈O．05）；A组患者收缩压、舒张压均较B组患者偏高，但差异均无统计学意义（P〉0．05）。眼部各变量因素分析显示，A组、B组患者与C组患者眼轴长度，前房深度，晶状体厚度差异均有统计学意义（F=41．797，7．449，19．271，P〈0．05）。PDR患者组间比较，A组患者眼轴明显短于B组患者眼轴，差异有统计学意义（P〈0．05）。多因素Logistic回归分析显示DM发病年龄、短眼轴是10年内2型DM患者并发严重PDR的独立危险因素（OR=0．366，2．909，P〈0．05）。结论不同病程2型DM患者并发严重PDR的DM发病年龄和眼轴存在差异，DM发病年龄晚、眼轴较短是2型DM患者10年内并发严重PDR中的独立危险因素。
- 王月欣陈松段红涛孔佳慧董蒙李泽东王昀
- 关键词：糖尿病视网膜病变眼轴发病年龄
- 玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞对糖尿病大鼠血-视网膜屏障的保护作用被引量：8
- 2017年
- 目的：探讨由人脐带间充质干细胞（hUCMSC）体外诱导的神经干细胞（NSC）经玻璃体腔注射途径移植对糖尿病视网膜病变（DR）大鼠血-视网膜屏障（BRB）的保护作用。方法实验研究。应用随机数字表法将60只Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为正常对照组、DR模型对照组及NSC治疗组。DR模型对照组和NSC治疗组大鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型。于糖尿病成模后3个月，NSC治疗组大鼠右眼玻璃体腔注射2μl NSC悬液；DR模型对照组大鼠右眼注射等容量PBS；上述两组大鼠左眼及正常对照组大鼠双眼不给予任何干预。干预后1个月，采用伊文思蓝（EB）灌注血管视网膜铺片观察视网膜血管形态及渗漏情况；EB定量检测BRB破坏情况；观察视网膜组织病理学改变情况。组间总体差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett t检验。结果 EB灌注视网膜铺片检查显示，正常对照组大鼠视网膜血管无明显异常，无EB渗漏到血管外；DR模型对照组背景荧光增强，可见明显的EB渗漏高荧光区；NSC治疗组背景荧光略增强，EB渗漏区较DR模型组明显减少。EB渗漏定量分析显示，正常对照组、DR模型对照组及NSC治疗组EB平均渗漏量分别为（9.91±1.53）、（24.67±2.26）及（12.85±2.58）μg/g，组间总体差异有统计学意义（F=103.801，P〈0.01）。DR模型对照组大鼠视网膜平均EB渗漏量较正常对照组增加（q=15.306，P〈0.05）；NSC治疗组较DR模型对照组明显减少（q=9.748，P〈0.05）。视网膜组织病理学检查示正常对照组视网膜各层结构清晰、排列整齐、形态正常；DR模型对照组视网膜细胞排列较紊乱，神经纤维层水肿明显，细胞核肿胀、体积增大，细胞密度降低；NSC治疗组视网膜细胞较DR模型对照组略整齐，介于两组之间。结论 hUCMSC诱导的NSC经玻璃体腔途径移植，能够改善BRB功能，减少早期DR大鼠血
- 董蒙张惟陈松王继明段红涛孔佳慧王月欣毕雪宋建
- 关键词：神经干细胞血视网膜屏障玻璃体内注射间质干细胞移植
- 基质金属蛋白酶与糖尿病视网膜病变关系研究进展被引量：6
- 2015年
- 糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最严重的并发症之一。尽管之前已经做了很多关于其发病机制的研究，但其确切的分子发病机制仍需深入研究。在DR的发病机理中，线粒体受损和炎性介质的上调发生在相关组织损伤之前。基质金属蛋白酶（MMPs）对细胞凋亡和新生血管生成等许多细胞功能都具有调节作用。研究表明在DR患者和动物模型中，其视网膜和玻璃体腔中均显示MMP2和MMP9含量增加。最近的研究表明，MMPs在DR的形成及发病过程中具有双重作用：在疾病初期，MMP2和MMP9可能是通过破坏线粒体促进视网膜毛细管细胞的凋亡；在发病的后期，促进新生血管的形成。文中将对MMPs，尤其是MMP2、9在DR的形成和发展的作用做以下综述，并列出MMP2、9抑制剂治疗DR的现有证据，为预防和控制DR的形成和发展提供新的思路和方案。
- 孔佳慧陈松
- 关键词：基质金属蛋白酶2基质金属蛋白酶9
