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产气肠杆菌组成型启动子的筛选及其活性测定被引量：2: 2016年; 目的：从产气肠杆菌基因组中筛选组成型启动子，并检测其活性。方法用Sau3 AⅠ限制性内切酶将产气杆菌的基因组酶切到500 bp大小，连接到pCMR8 a载体上，转化DH5α感受态后涂布氯霉素和卡那抗生素的双抗平板上筛选启动子，经SDS－PAGE分析启动子的蛋白表达能力，筛选较强启动子并对其进行截短和顺反性实验，最后利用截短启动子表达不同的蛋白。结果成功筛选到了5个启动子序列，获得到了表达能力最强启动子的截短核心序列，验证了其具有反向启动外源蛋白表达的能力，成功表达了其他外源蛋白。结论本实验通过大肠埃希菌表达系统成功的筛选并验证了产气杆菌的一种组成型启动子，具有较强的启动外源蛋白表达能力，对工业上蛋白的生产及实验室表达某种蛋白具有重要意义。; 苑荣亮仉秋实汪玉婷岳风先刘志成张成井敏敏毛小琴井申荣; 关键词：产气肠杆菌组成型启动子蛋白表达活性测定

昆明地区人输血传播病毒分子流行病学研究被引量：2: 2014年; 目的检测昆明市体检人群血清输血传播病毒,研究该地区第4和第5组群输血传播病毒分子流行病学特征。方法聚合酶链反应检测血清输血传播病毒,阳性样品测序后进行同源性和系统进化分析。结果检测了224份血清,通过序列测定和比对确定了151份阳性样品,病毒感染率为67.41%(151/224),第4组群和第5组群分别检测到48份和79份,混合感染10份,两组群输血传播病毒流行率为21.43%(48/224)和35.27%(79/224),混合感染率为4.46%(10/224)。结论获得了昆明地区第4和第5组群输血传播病毒流行病学数据,为昆明地区输血传播病毒的预防奠定基础。; 李攀张成崔成成杨思达曾韦锟黄芬井申荣; 关键词：输血传播病毒分子流行病学

人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1表达纯化及多克隆抗体的制备被引量：1: 2016年; 目的：表达纯化人星状体病毒（ human astrovirus， HAstV）非结构蛋白nsP1a／1，免疫动物制备多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增nsP1a／1基因序列，构建到大肠埃希菌原核表达系统中表达重组nsP1a／1蛋白，使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）和二噻啉甲酸（BCA）实验对重组蛋白的纯度与浓度进行分析，以重组的nsP1a／1蛋白为抗原，免疫雄性SPF级SD 大鼠获得多抗血清，用 ELISA 测定抗体效价、 Western 印迹检测抗体特异性。结果nsP1a／1-pET28a原核表达载体构建成功，将其转化至大肠埃希菌BL21（DE3）细菌中诱导表达了重组蛋白，免疫大鼠获得的多抗血清几何平均效价达到1∶406374。结论本实验成功地运用原核表达系统表达并鉴定了人星状体病毒非结构蛋白nsP1a／1，为进一步研究人星状病毒的复制及病毒感染的临床诊断奠定基础。; 苑荣亮崔成成井敏敏刘志成汪玉婷岳风先张成井申荣毛小琴; 关键词：多克隆抗体 NON-STRUCTURAL PROTEINS

柯萨奇病毒A16型2 B基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及其特性鉴定: 2016年; 目的：构建柯萨奇病毒A16的2B基因的酵母诱饵表达载体，用于筛选与2B相互作用的蛋白。方法 PCR扩增2B全序列，克隆入pGBKT7？BD，将构建好的 pGBKT7？2B转化到酵母细胞 Y2HGold；用Western印迹分析诱饵蛋白的表达，检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应。结果成功克隆了pGBKT7？2B并转化至Y2 HGold中，转化细胞Y2 HGold [pGBKT7？2B]可以表达诱饵蛋白2B，2B蛋白对转化细胞无细胞毒性和自激活效应。结论成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7？2B，可用于酵母双杂交筛选与2B蛋白相互作用的宿主靶蛋白。; 张成刘志成苑荣亮黄芬井申荣; 关键词：酵母双杂交柯萨奇病毒A16

人星状病毒非结构蛋白nsP1a/3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备被引量：1: 2015年; 目的原核表达、纯化人星状病毒(human astrovirus,HAstV)非结构蛋白nsP1a/3,并制备多克隆抗体。方法酶切质粒nsP1a/3-pCDNA3.1,获得nsP1a/3基因,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒nsP1a/3-pET-28a,转化大肠埃希菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,并优化表达条件。表达的重组蛋白经Ni2+亲和层析纯化后,经腹腔免疫SD大鼠,共4次,最后1次免疫7 d后,经心脏采血,分离血清,ELISA法检测多抗效价,Western blot鉴定多抗的特异性。结果重组表达质粒nsP1a/3-pET-28a经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为22500,以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度为86.6%,浓度为1.26mg/ml;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶30 000,且特异性较好。结论成功地原核表达、纯化了HAstV非结构蛋白nsP1a/3,并制备了特异性良好的鼠多克隆抗体,为进一步研究nsP1a/3蛋白在病毒侵染靶细胞时的作用机制奠定了基础。; 李攀张成杨思达崔成成刘志成曾韦锟黄芬井申荣; 关键词：原核细胞纯化多克隆抗体

人星状病毒非结构蛋白nsP1 a／1相互作用的宿主细胞靶蛋白筛选被引量：7: 2016年; 目的：利用细菌双杂交技术筛选与人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1相互作用的蛋白。方法培养人肠道细胞HT29，提取基因组，利用细菌双杂交系统载体pUT18 C构建HT29基因组文库，同时构建诱饵载体nsP1a／1-pKT25。将文库和诱饵载体共转化进入细菌BTH101，在M63培养基上进行筛选。结果通过酶切鉴定以及测序分析，诱饵载体构建正确，并且利用细菌双杂交技术成功从HT29细胞基因组文库中筛选出能与人星状病毒非结构蛋白 nsP1a／1相互作用的蛋白。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1的诱饵载体，在HT29细胞基因组文库中筛选得到了3个与nsP1a／1相互作用的蛋白，为进一步研究人星状病毒在细胞内的增殖和防治药物的应用奠定基础。; 刘志成苑荣亮张成汪玉婷黄芬井申荣; 关键词：HT29细胞

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张成