为了研究旱柳Salix matsudana高耐盐无性系I-32的耐盐机制,分离其耐盐相关基因,实验以筛选出的高耐盐旱柳无性系I-32为材料,盐胁迫后提取总核糖核酸(RNA),纯化mRNA,利用改良SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术合成了全长cDNA,回收500bp以上cDNA大片段克隆到大肠杆菌Escherichia coli和酵母穿梭载体pYES2.1中,建成旱柳全长cDNA文库,对随机挑取的阳性克隆进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定,插入片断平均值为1000bp左右,说明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选和表达的建库要求。通过尿嘧啶缺陷型培养基添加80～130g·L-1氯化钠筛选文库,与野生型酵母菌株相比,转化子的耐盐能力提高。研究结果为克隆与旱柳抗旱相关基因奠定了基础。
以旱柳Salix matsudana及东南景天Sedum alfredii为实验材料,利用改进的SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术分别构建了旱柳盐胁迫和东南景天氯化镉胁迫后的全长cDNA文库,把文库包装到酵母表达载体中,转化酿酒酵母感受态细胞,通过在尿嘧啶缺陷型培养基上添加不同浓度梯度的筛选压来筛选酵母高抗转化子,并对其基因进行鉴定。结果从旱柳盐胁迫全长cDNA文库中得到了2个能耐受1.709mol·L-1氯化钠的阳性转化子,从东南景天氯化镉胁迫全长cDNA文库中得到了2个能耐受0.123mmol·L-1氯化镉的阳性转化子。分别测定对照菌(转空载体重组菌INV/pYES2.1)和转cDNA重组菌在无胁迫、高盐(1mol·L-1氯化钠)和高氯化镉(150μmol·L-1)胁迫下的生长曲线。结果表明高耐盐/耐镉相关基因的表达对酵母正常生长没有影响。在含高盐或者高镉的培养基里,2个转基因重组菌的延滞期短于对照菌。这表明高耐盐/耐镉相关基因的表达可以提高酵母细胞的耐盐/耐镉能力。对6号耐盐转化子序列进行生物信息学和表达模式分析,发现该基因为一盐胁迫应答相关基因SMpla6(暂定名)。用酿酒酵母建立了一个高效快速筛选植物抗逆基因的体系,研究结果为快速克隆植物抗逆相关基因奠定基础。
