李剑波
- 作品数：17 被引量：30H指数：3
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- 柯萨奇病毒A16型衣壳蛋白VP1～VP3的B淋巴细胞线性抗原表位预测与确定被引量：7
- 2015年
- 目的 确定柯萨奇病毒A16型（CVA16）YY157株衣壳蛋白VP1～VP3的优势B淋巴细胞线性抗原表位。方法用生物信息学软件Lasergene分析CVA16YY157株衣壳蛋白VP1-VP3氨基酸序列的亲水性、抗原性和表面可及性，预测出包含潜在B淋巴细胞线性抗原表位的区段，并用BepiPred1．0Server进行评估。人工合成相应的多肽片段，用多肽-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其与明确感染CVA16的患儿血清的阳性反应与否和程度，并以健康人血清作比较。结果根据抗原性强、亲水性强和表面性好的要求，共预测出21个可能的B淋巴细胞线性抗原表位。相应的人工合成多肽与感染CVA16的患儿血清均呈现阳性反应，但程度不同。结论成功预测并用实验证实了CVA16YY157株衣壳蛋白VP1～VP3的优势线性B淋巴细胞线性抗原表位。
- 高孟倪红霞朱莲李剑波高丽美罗永能
- 关键词：柯萨奇病毒感染酶联免疫吸附测定
- 表达人乳头瘤病毒16型E6E7重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫和抗肿瘤效应被引量：2
- 2014年
- 目的评价HPVl6E6E7的复制缺陷型重组5型腺病毒（PK—HPV—ad5）治疗性疫苗对实验小鼠免疫应答和抗肿瘤的生物学效应。方法使用基因重组技术构建PK—HPV—ad，疫苗，并通过小鼠免疫试验，检测小鼠总抗体和特异性IFNl，同时将造模小鼠分成疫苗组和对照组，分别对其进行抑瘤试验、TC-1肿瘤细胞挑战试验和肿瘤切除后防复发试验。结果HPV16E6E7诱导的总抗体第12天的水平相对较高（1：400～1：600）；3批次疫苗特异性IFNl在第14天与对照组比较分别升高8．6、5．9和8．9倍，差异有统计学意义（t=15．721、6．967和14．342，P均〈0．01）。抑瘤试验表明疫苗剂量为10^7IU／只时小鼠肿瘤生长率为0，与对照组比较差异有统计学意义（确切概率法，P〈0．01），3批次疫苗验证有效剂量为10^7IU／只时肿瘤抑制率可达80％（8／10）以上。TC-1肿瘤细胞挑战试验结果显示：小鼠先接种疫苗能引起特异性的免疫应答，并能保护90％（9／10）的小鼠免受TC-1肿瘤细胞的攻击；肿瘤切除后防止复发试验提示在注射相同剂量疫苗时，对10^4个，只和10^5个／只肿瘤细胞造模小鼠，第0、5天免疫组肿瘤复发数少于第5，8天免疫组（1／10，4／10VS8／10，7／10）。结论PK—HPV—ads疫苗能诱导小鼠产生特异性的免疫应答，对抗肿瘤复发有治疗潜力。
- 吴洁陈刚金素凤高孟庄昉成李剑波姜云水毛子安
- 关键词：腺病毒疫苗抗肿瘤作用
- HEK293细胞的传代、建库与高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒的研究被引量：1
- 2015年
- 目的对HEK293细胞进行三级细胞库的建立,并高效表达重组的HPV16-E6E7腺病毒。方法进行HEK293细胞传代培养,并建立三级细胞库,按中国药典2010年版III部要求进行常规检验;培养重组HPV16-E6E7腺病毒,测定滴度,插入目的基因以及基因组酶切图谱鉴定。结果 HEK293细胞传代符合其生长形态,建立的三级细胞库和不同细胞库之间的传代数,细胞浓度和装量均符合疫苗基质制备的要求;能高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒,种子滴度>3.0×109 IU·m L?1;表达的目的基因和目的蛋白稳定。结论建立的HEK293三级细胞库符合疫苗用细胞基质的要求。
- 吴洁李剑波高孟金素凤潘海桦陈刚姜云水庄昉成
- 关键词：HEK293细胞库HPV16
- 微载体技术高密度培养MRC-5细胞初探被引量：2
- 2014年
- 目的 通过探索MRC-5细胞的微载体培养条件,以期建立MRC-5细胞的高密度培养方法.方法 用3种不同培养基（MEM、M199、DMEM）分别培养3.0×104/mL的MRC-5细胞,观察它们的细胞增殖及传代能力；在Spinner培养系统中,用1.0 g/L Cytopore 2和3.0 g/L Cytodex 3分别培养密度为3.70× 105/mL和2.98×105/mL的MRC-5细胞,观察两种载体对细胞生长代谢和细胞密度的影响,筛选出最适宜的培养基及微载体.使用5 L CelliGen310生物反应器对筛选获得的培养基及微载体进行MRC-5细胞的灌流培养初步摸索.结果 MRC-5细胞在MEM、M199、DMEM培养基中培养96 h细胞分别增殖了7.0、4.4和3.0倍；在MEM培养基中连续传代至5次以上,细胞增殖稳定,1：3传代72 h形成致密单层,而在M199和DMEM培养基中连续传代均未能获得理想的细胞形态.经96～120 h的培养后,使用1.0 g/L Cytopore 2培养的MRC-5细胞密度达到2.20× 106/mL高于使用3.0 g/L Cytodex 3的1.12×106/mL,且前者葡萄糖和乳酸代谢较后者更为活跃.首选MEM和Cytopore 2作为MRC-5细胞的灌流培养体系.在5L生物反应器中以1.0 g/L Cytopore 2和2.5LMEM培养基培养MRC-5细胞至144h,细胞密度达到1.54×106/mL.结论 初步建立的MEM Cytopore 2微载体细胞培养方法能够获得高密度、活性良好的MRC-5传代细胞.
- 姜云水李剑波顾春燕陈科达唐彩华包佳源毛岱敏张峰庄昉成王平
- 关键词：细胞培养技术微载体
- 非甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸对人乳头瘤病毒治疗性蛋白疫苗的免疫佐剂作用被引量：2
- 2013年
- 目的研究非甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）联合宫颈癌治疗性融合蛋白疫苗HPV16L2ESET（以下简称蛋白疫苗）诱导小鼠产生的免疫应答及其在肿瘤免疫治疗中的免疫佐剂作用。方法免疫学试验：108只雌性C57BL／6小鼠随机分成CpG组、蛋白疫苗组、CpG＋蛋白疫苗组，每组36只，分别肌肉注射CpG-ODN（10μg／只）、蛋白疫苗（120μg／只）、蛋白疫苗（120μg/只）和CpG-ODN（10μg／只）的混合溶液，免疫程序为0,3、7d；ELISPOT法检测IFN-T，间接ELISA法检测IgG抗体水平，分别评价小鼠产生的细胞及体液免疫效果。肿瘤抑制试验：将40只雌性C57BL／6小鼠皮下接种TC．1肿瘤细胞（1×104／只），24h后随机分成4组接种疫苗，每组10只，CpG组、蛋白疫苗组和CpG＋蛋白疫苗组分别肌肉注射CpG-ODN（10μg/只）、蛋白疫苗（120μg／只）、蛋白疫苗（120μg／只）和CpG-ODN（10μg／只）的混合溶液，免疫程序为0、3、7d；对照组不给药。通过成瘤率分析抗肿瘤效果。结果免疫学试验表明，免疫后14、21和28d,CpG＋蛋白疫苗组小鼠分泌IFN-y的T细胞高于蛋白疫苗组（Z=-2．36、-3．58、-3．58，P均〈0．05），在21d达到最高水平；免疫后5周，CpG＋蛋白疫苗组IgG抗体滴度维持在1：1×105左右，其中在10、14、21、42d与蛋白疫苗组比较差异显著（t=6．15、5．84、4．57、7．91，P均〈0．01）；抑瘤试验表明，蛋白疫苗组能延缓肿瘤生长，成瘤率为40％，添加CpG-ODN后，成瘤率降为0（x^2=5．00，P〈0．05）。结论将CpG-ODN与HPV16L2E6E7融合蛋白疫苗联合应用，可以诱导C57BL／6雌性小鼠产生更强的特异性体液和细胞免疫应答，对荷瘤鼠有更好的抗肿瘤效果，有望提高疫苗的免疫治疗效果。
- 吴小红吴洁陈刚金素凤高孟陈科达姜云水李剑波罗永能庄昉成
- 关键词：CPGODN肿瘤免疫治疗
- 肠道病毒71型衣壳蛋白VP1的原核表达和纯化及其抗原性和免疫原性的验证被引量：2
- 2013年
- 目的 探究利用大肠埃希菌原核表达系统表达的肠道病毒71型（EV71）衣壳蛋白VP1的抗原性和免疫原性.方法 将EV71 H3-TY株的VP1基因通过PCR扩增,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点,定向克隆至pET44a-EV71 VP1表达载体,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,并用IPTG诱导VP1的表达.然后将表达的重组VP1 （rVP1）经超声、离心和Ni-NTA亲和层析柱纯化并透析复性,用Western免疫印迹法和先前建立的夹心ELISA等方法检测其抗原活性,同时用rVP1免疫兔子并通过测定其诱导的特异性抗体水平来确定其免疫原性.结果 rVP1在大肠埃希菌中主要表达于包涵体中,但能被顺利且有效地纯化和复性.SDS-PAGE显示表达的rVP1相对分子质量约为34 000,与预期大小相符.纯化的rVP1可分别与兔抗EV71多克隆抗体、大鼠抗EV71 VP1单克隆抗体（单抗）和小鼠抗EV71 VP1单抗进行特异性免疫应答.rVP1免疫兔诱导产生的特异性抗体效价高达729 000,高于本底效价,且差异有统计学意义（t=2.646,P＜0.01）.结论 EV71 VP1在大肠埃希菌原核表达系统中得以成功表达,纯化的rVP1具有良好的抗原活性和免疫原性.
- 朱赟李剑波高孟唐彩华罗永能
- 关键词：肠道病毒感染衣壳蛋白原核表达
- 人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用被引量：1
- 2015年
- 目的建立人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗（HPV16 L2E6E7）酶联免疫的检测方法,用于疫苗发酵过程中的重组蛋白表达的监控。方法用常规方法制备兔抗HPV16 L2E6E7多克隆抗体作为包被抗体,商品化小鼠抗HPV16 E7单克隆抗体为检测抗体,夹心ELISA方法检测HPV16 L2E6E7抗原参考品,建立抗原标准曲线,确定线性范围及检测限,同时验证该方法的特异性。结果建立了检测HPV16 L2E6E7抗原含量的夹心ELISA方法,抗原参考品系列浓度在19.53~1 250 ng·m L-1内有很好的线性（R2〉0.99）和回收率（90%~110%）;特异性好,不受发酵液中宿主菌蛋白的干扰。结论建立了人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗重组抗原含量的测定方法,为该疫苗的发酵工艺的质控提供了有效技术手段。
- 李剑波潘海桦姜云水吴洁陈刚高孟金素凤吴小红包佳源陈科达庄昉成
- 关键词：人乳头瘤病毒16型重组蛋白抗体
- 短串联重复序列图谱分析法鉴定HEK293细胞传代的稳定性
- 2012年
- 目的用短串联重复序列（STR）图谱20位点分析法对疫苗研发用HEK293细胞的传代稳定性进行研究。方法对购自美国菌毒种保管中心（ATCC）的HEK293细胞进行传代，按中国药典三部要求建立主种子库（第40代），工作种子库（第43代）和生产终末细胞（第65代），并进行SIR检测；按检测要求进行细胞扩增，DNA提取，PCR扩增及SIR20位点分析。结果STR图谱20位点分析法已全面覆盖美国ATCC9位点和中检院16位点法，三级传代细胞检测结果与ATCC标准株293EcRShh（Adv5）匹配度100％，与中检院检测结果完全一致，无外源细胞的污染。结论本实验室传代建库的HEK293细胞遗传稳定，无外源细胞污染，符合疫苗研发用要求。
- 吴洁李剑波毛子安吴小红陈科达高孟陈刚姜云水金素凤庄昉成
- 关键词：串联重复序列HEK293
- 柯萨奇病毒A组6型对长爪沙鼠的感染性研究
- 2019年
- 目的 研究柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A group 6 type, CV-A6)对长爪沙鼠的感染性。方法 选取5个不同日龄组的长爪沙鼠,腹腔接种1×105 TCID50/只CV-A6 XS45株进行攻毒试验,观察各组病态症状,确定长爪沙鼠合适的攻毒日龄;而后选取合适日龄长爪沙鼠用3个剂量进行攻毒,观察剂量效应关系;攻毒长爪沙鼠病理组织(脑、肌肉、肠道)的病毒载量情况用荧光定量RT-PCR进行检测,组织感染病变情况用免疫组化进行检测。结果 1×105 TCID50/只的攻毒量CV-A6可造成7~35日龄长爪沙鼠100%发病、死亡,攻毒长瓜沙鼠症状评分变化趋势与鼠龄呈正相关;1×103 TCID50/只、1×104 TCID50/只、1×105 TCID50/只剂量组攻毒均可引起28日龄长爪沙鼠100%发病、死亡,攻毒长爪沙鼠症状评分变化趋势与攻毒剂量呈负相关;攻毒长爪沙鼠脑、肌肉、肠道组织均有不同程度的病毒载量,其中肌肉中的病毒载量高于其他组织,且组织中均发现病毒感染后细胞病变区域。结论 长爪沙鼠对CV-A6有很强的发病及死亡敏感性,可以作为理想的动物感染模型。
- 高孟高丽美吴洁李剑波周冬杨宏宏罗永能
- 关键词：长爪沙鼠
- 氢氧化铝对人乳头瘤病毒16型L2E6E7融合蛋白免疫增强作用的初步研究
- 2013年
- 目的 初步评价Al(OH)3对重组HPV16的L2E6E7融合蛋白(简称HPV16L2E6E7)的免疫佐剂作用.方法 将108只雌性C57BL/6小鼠随机分成Al(OH)3组(85.7 μg/只,肌肉注射)、HPV16L2E6E7组(120.0μg/只,肌肉注射)、A1 (OH)3+HPV16L2E6E7组[每只 Al(OH)3 85.7μg+HPV16L2E6E7120.0μg,肌肉注射],每组36只,免疫程序为0、3、7d.ELISPOT法检测IFN-γ,间接ELISA法检测IgG抗体水平.另将40只皮下接种TC-1肿瘤细胞(1×104/只)的雌性C57BL/6小鼠随机分为PBS组(100.0 μL)、Al (OH)3组(85.7μg/只,肌肉注射)、HPV16L2E6E7组(120.0μg,/只,肌肉注射)、Al(OH)3+ HPV16L2E6E7组[每只Al(OH)385.7μg+HPV16L2E6E7 120.0μg,肌肉注射],每组10只.免疫程序为0、3、7d.观察肿瘤形成时间、体积变化及成瘤率,观察期为53 d.结果 免疫后第10、14、21、28、35和42d,HPV16L2E6E7组与Al(OH)3+HPV16L2E6E7组IgG抗体滴度都高于Al(OH)3对照组,差异具有统计学意义(P均＜0.01),免疫后21、28、35、42 d Al(OH)3+ HPV16L2E6E7组特异性IgG抗体显著高于HPV16L2E6E7组(P均＜0.01);免疫后14、21、28d Al(OH)3+ HPV16L2E6E7组E7特异性IFN-γ水平显著高于HPV16L2E6E7组(P均＜0.01);小鼠抑瘤实验中,HPV16L2E6E7组抑瘤率为60％,Al(OH)3+ HPV16L2E6E7抑瘤率为40％,两组无明显差异(P＞0.05),但与对照组比较都有显著性差异(P＜ 0.01,P＜0.05).结论 初步评价Al(OH)3能与HPV16L2E6E7较好吸附,可诱导C57BL/6雌性小鼠产生更强的特异性体液和细胞免疫应答,具有免疫增强作用.
- 吴小红吴洁陈刚金素凤高孟陈科达姜云水李剑波罗永能
- 关键词：人乳头瘤病毒16融合蛋白氢氧化铝免疫佐剂
