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人参皂甙Rg1对HPV16 L2 E6 E7融合蛋白疫苗的免疫佐剂作用研究: 2016年; 宫颈癌（ cervical carcinoma）是威胁女性健康的第二大恶性肿瘤,其危害程度仅次于乳腺癌。据国际癌症中心（ In-ternational Agency for Research on Cancer,IARC）统计,全球每年宫颈癌的新发病例约为49.3万,死亡人数约为27.4万。Papovaviridae科的人乳头瘤病毒（ human papillomaviruses, HPV）感染是导致宫颈癌发生的重要原因,目前已发现它有170多种亚型,而75%以上的宫颈癌患者感染了16、18、31和45型的HPV病毒。; 苏小艳王云皓徐伟吴洁关然何珊珊陈刚胡松华; 关键词：人参皂甙RG1 HPV16 蛋白疫苗宫颈癌发生 E6 E7

重组4-1BB配体对治疗性重组人乳头瘤病毒16型蛋白疫苗的佐剂作用: 2017年; 目的研究重组4-1BB配体（recombinant 4-1BB ligand，r4—1BBL）作为佐剂对治疗性重组人乳头瘤病毒16型（humanpapillomavirus16，HPVl6）蛋白疫苗（HPVl6蛋白疫苗）免疫效果的影响。方法对4-1BBL胞外功能区进行密码子优化，并通过NdeI和XhoI酶切位点定向插入pET28a表达载体。将获得的重组表达载体转化至大肠埃希菌BL21（DE3），并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白表达。用蛋白质印迹法对重组蛋白进行鉴定，并用非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电子显微镜分析重组蛋白结构。用CCK-8试剂盒检测纯化r4-IBBL对小鼠T细胞体外增殖的影响。同时将r4-1BBL与HPV16蛋白疫苗联合免疫C57BL／6小鼠，用酶联免疫斑点试验检测小鼠的细胞免疫应答水平，观察r4-1BBL对HPV16蛋白疫苗抑制肿瘤生长的影响。结果密码子优化的4-1BBL胞外功能区能在重组表达载体中表达，且表达产物同时以包涵体和可溶性形式存在。可溶性产物的结构主要为二聚体，电子显微镜下可以观察到类似亚单位的结构。纯化r4-1BBL可促进小鼠脾淋巴细胞的体外增殖。与单纯HPV16蛋白疫苗相比，r4—1BBL联合HPV16蛋白疫苗能诱导更强的特异性细胞免疫应答（t=3．525，P=0．024）和产生更明显的肿瘤生长抑制作用（t=2．534，P=0．021）。结论r4-1BBLL在小鼠中提高HPV16蛋白疫苗的免疫效果，具有作为HPV16蛋白疫苗佐剂的潜力。; 高孟高丽美朱赟陈刚吴洁许玲敏罗永能庄昉成; 关键词：佐剂免疫人乳头瘤病毒16

人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用被引量：1: 2015年; 目的建立人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗（HPV16 L2E6E7）酶联免疫的检测方法,用于疫苗发酵过程中的重组蛋白表达的监控。方法用常规方法制备兔抗HPV16 L2E6E7多克隆抗体作为包被抗体,商品化小鼠抗HPV16 E7单克隆抗体为检测抗体,夹心ELISA方法检测HPV16 L2E6E7抗原参考品,建立抗原标准曲线,确定线性范围及检测限,同时验证该方法的特异性。结果建立了检测HPV16 L2E6E7抗原含量的夹心ELISA方法,抗原参考品系列浓度在19.53~1 250 ng·m L-1内有很好的线性（R2〉0.99）和回收率（90%~110%）;特异性好,不受发酵液中宿主菌蛋白的干扰。结论建立了人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗重组抗原含量的测定方法,为该疫苗的发酵工艺的质控提供了有效技术手段。; 李剑波潘海桦姜云水吴洁陈刚高孟金素凤吴小红包佳源陈科达庄昉成; 关键词：人乳头瘤病毒16型重组蛋白抗体

金刚藤胶囊对慢性盆腔炎大鼠盆腔粘连的作用及其药理机制被引量：10: 2020年; 目的:研究金刚藤胶囊抗慢性盆腔炎大鼠盆腔粘连的作用及其药理机制。方法:选择未交配雌性大鼠,随机分为假手术对照组、模型对照组、妇科千金片0. 15 g/kg组、金刚藤胶囊1. 2、2. 4、4. 8 g/kg组。除假手术对照组外,各组大鼠均采用机械和混合细菌液感染双重损伤法制作盆腔粘连模型。造模后,除假手术对照组、模型对照组外,各组大鼠灌胃给予相应药物连续20 d。末次药后,采用Verco评价标准对大鼠盆腔粘连进行评分,取子宫组织进行形态观察和HE染色进行病理观察,ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、局部粘连组织的转化生长因子-β(TGF-β)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)含量以及组织型纤溶酶原激活剂(t PA)、纤溶酶原激活剂抑制因子-1(PAI-1)活性。荧光定量PCR法检测大鼠子宫组织TGF-β、MMP-9、t PA和PAI-1mRNA的表达。结果:与假手术对照组比较,模型对照组大鼠子宫盆腔粘连评分和组织病理病变程度增加,血清TNF-α、IL-β含量明显升高,子宫组织的TGF-β含量、PAI-1活性增高,mRNA相对表达量上调,而MMP-9含量、t PA活性明显降低,其mRNA表达明显下调(P <0. 05或P <0. 01)。与模型对照组比较,金刚藤胶囊2. 4、4. 8 g/kg组和妇科千金片组使大鼠子宫盆腔粘连评分和组织病理病变程度降低,血清TNF-α、IL-β含量明显下降,子宫组织的TGF-β含量和PAI-1活性明显降低,其mRNA相对表达量均明显下调,而MMP-9含量、t PA活性明显升高,其mRNA表达均明显上调(P <0. 05或P <0. 01)。结论:金刚藤胶囊能改善慢性盆腔炎大鼠的子宫炎症及炎性粘连,其作用与调节粘连形成因子和粘连蛋白溶解因子的表达有关。; 李筠陈刚; 关键词：金刚藤胶囊盆腔粘连炎性因子纤溶因子

高迁移率族蛋白B1及其在宫颈癌中的作用被引量：2: 2017年; 胞外的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）与晚期糖基化终末产物受体、Toll样受体、趋化因子CXCL12等相关受体及肿瘤信号调控通路作用引起持续的炎症反应，并最终促进肿瘤发生。在宫颈癌患者中，HMGB1的表达水平随宫颈癌变级别的升高而增加，HMGB1通过多种途径参与宫颈癌的发生发展、浸润和转移过程。应用RNA干扰技术可以抑制HMGB1基因表达，从而影响宫颈癌细胞的增殖、侵袭和分化，这为抗肿瘤药物的研发提供了新的思路。; 陈刚庄昉成; 关键词：宫颈肿瘤炎症抗肿瘤药

表达人乳头瘤病毒16型E6E7重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫和抗肿瘤效应被引量：2: 2014年; 目的评价HPVl6E6E7的复制缺陷型重组5型腺病毒（PK—HPV—ad5）治疗性疫苗对实验小鼠免疫应答和抗肿瘤的生物学效应。方法使用基因重组技术构建PK—HPV—ad，疫苗，并通过小鼠免疫试验，检测小鼠总抗体和特异性IFNl，同时将造模小鼠分成疫苗组和对照组，分别对其进行抑瘤试验、TC-1肿瘤细胞挑战试验和肿瘤切除后防复发试验。结果HPV16E6E7诱导的总抗体第12天的水平相对较高（1：400～1：600）；3批次疫苗特异性IFNl在第14天与对照组比较分别升高8．6、5．9和8．9倍，差异有统计学意义（t=15．721、6．967和14．342，P均〈0．01）。抑瘤试验表明疫苗剂量为10^7IU／只时小鼠肿瘤生长率为0，与对照组比较差异有统计学意义（确切概率法，P〈0．01），3批次疫苗验证有效剂量为10^7IU／只时肿瘤抑制率可达80％（8／10）以上。TC-1肿瘤细胞挑战试验结果显示：小鼠先接种疫苗能引起特异性的免疫应答，并能保护90％（9／10）的小鼠免受TC-1肿瘤细胞的攻击；肿瘤切除后防止复发试验提示在注射相同剂量疫苗时，对10^4个，只和10^5个／只肿瘤细胞造模小鼠，第0、5天免疫组肿瘤复发数少于第5，8天免疫组（1／10，4／10VS8／10，7／10）。结论PK—HPV—ads疫苗能诱导小鼠产生特异性的免疫应答，对抗肿瘤复发有治疗潜力。; 吴洁陈刚金素凤高孟庄昉成李剑波姜云水毛子安; 关键词：腺病毒疫苗抗肿瘤作用

非甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸对人乳头瘤病毒治疗性蛋白疫苗的免疫佐剂作用被引量：2: 2013年; 目的研究非甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）联合宫颈癌治疗性融合蛋白疫苗HPV16L2ESET（以下简称蛋白疫苗）诱导小鼠产生的免疫应答及其在肿瘤免疫治疗中的免疫佐剂作用。方法免疫学试验：108只雌性C57BL／6小鼠随机分成CpG组、蛋白疫苗组、CpG＋蛋白疫苗组，每组36只，分别肌肉注射CpG-ODN（10μg／只）、蛋白疫苗（120μg／只）、蛋白疫苗（120μg/只）和CpG-ODN（10μg／只）的混合溶液，免疫程序为0,3、7d；ELISPOT法检测IFN-T，间接ELISA法检测IgG抗体水平，分别评价小鼠产生的细胞及体液免疫效果。肿瘤抑制试验：将40只雌性C57BL／6小鼠皮下接种TC．1肿瘤细胞（1×104／只），24h后随机分成4组接种疫苗，每组10只，CpG组、蛋白疫苗组和CpG＋蛋白疫苗组分别肌肉注射CpG-ODN（10μg/只）、蛋白疫苗（120μg／只）、蛋白疫苗（120μg／只）和CpG-ODN（10μg／只）的混合溶液，免疫程序为0、3、7d；对照组不给药。通过成瘤率分析抗肿瘤效果。结果免疫学试验表明，免疫后14、21和28d,CpG＋蛋白疫苗组小鼠分泌IFN-y的T细胞高于蛋白疫苗组（Z=-2．36、-3．58、-3．58，P均〈0．05），在21d达到最高水平；免疫后5周，CpG＋蛋白疫苗组IgG抗体滴度维持在1：1×105左右，其中在10、14、21、42d与蛋白疫苗组比较差异显著（t=6．15、5．84、4．57、7．91，P均〈0．01）；抑瘤试验表明，蛋白疫苗组能延缓肿瘤生长，成瘤率为40％，添加CpG-ODN后，成瘤率降为0（x^2=5．00，P〈0．05）。结论将CpG-ODN与HPV16L2E6E7融合蛋白疫苗联合应用，可以诱导C57BL／6雌性小鼠产生更强的特异性体液和细胞免疫应答，对荷瘤鼠有更好的抗肿瘤效果，有望提高疫苗的免疫治疗效果。; 吴小红吴洁陈刚金素凤高孟陈科达姜云水李剑波罗永能庄昉成; 关键词：CPGODN 肿瘤免疫治疗

HEK293细胞的传代、建库与高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒的研究被引量：1: 2015年; 目的对HEK293细胞进行三级细胞库的建立,并高效表达重组的HPV16-E6E7腺病毒。方法进行HEK293细胞传代培养,并建立三级细胞库,按中国药典2010年版III部要求进行常规检验;培养重组HPV16-E6E7腺病毒,测定滴度,插入目的基因以及基因组酶切图谱鉴定。结果 HEK293细胞传代符合其生长形态,建立的三级细胞库和不同细胞库之间的传代数,细胞浓度和装量均符合疫苗基质制备的要求;能高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒,种子滴度>3.0×109 IU·m L?1;表达的目的基因和目的蛋白稳定。结论建立的HEK293三级细胞库符合疫苗用细胞基质的要求。; 吴洁李剑波高孟金素凤潘海桦陈刚姜云水庄昉成; 关键词：HEK293 细胞库 HPV16

短串联重复序列图谱分析法鉴定HEK293细胞传代的稳定性: 2012年; 目的用短串联重复序列（STR）图谱20位点分析法对疫苗研发用HEK293细胞的传代稳定性进行研究。方法对购自美国菌毒种保管中心（ATCC）的HEK293细胞进行传代，按中国药典三部要求建立主种子库（第40代），工作种子库（第43代）和生产终末细胞（第65代），并进行SIR检测；按检测要求进行细胞扩增，DNA提取，PCR扩增及SIR20位点分析。结果STR图谱20位点分析法已全面覆盖美国ATCC9位点和中检院16位点法，三级传代细胞检测结果与ATCC标准株293EcRShh（Adv5）匹配度100％，与中检院检测结果完全一致，无外源细胞的污染。结论本实验室传代建库的HEK293细胞遗传稳定，无外源细胞污染，符合疫苗研发用要求。; 吴洁李剑波毛子安吴小红陈科达高孟陈刚姜云水金素凤庄昉成; 关键词：串联重复序列 HEK293

表达人乳头瘤病毒16型E6E7的重组腺病毒载体疫苗种子库遗传稳定性研究: 2013年; 目的了解表达人乳头瘤病毒(HPV) 16型E6和E7融合蛋白的重组腺病毒载体(Ad-HPV16E6E7)疫苗的主种子库(MSB)和工作种子库(WSB)的遗传稳定性.方法通过显微镜检查和病毒感染效价测定实验测定Ad-HPV16E6E7 MSB和WSB的感染性滴度;采用PCR扩增法鉴定HPV16E6E7目的基因稳定性;采用Western印迹法和免疫荧光法鉴定Ad-HPV16E6E7目的蛋白表达;采用C57BL/6小鼠TC-1肿瘤细胞生长抑制试验评价Ad-HPV16E6E7的生物学效应.结果 Ad-HPV16E6E7的MSB和WSB的感染性滴度分别为6.31×109 IU/mL和3.00×109 IU/mL;插入目的基因和表达目的蛋白稳定;小鼠TC-1肿瘤生长抑制试验表明MSB和WSB滴度的数量级在109 IU/mL时,小鼠抑瘤率达100％,与对照组相比差异均有统计学意义(x2=20.00、20.00,P均＜0.01).结论 Ad-HPV16E6E7疫苗的种子库遗传稳定,符合将来疫苗研发的要求.; 吴洁陈科达高孟毛子安陈刚金素凤庄昉成吴小红姜云水; 关键词：人乳头瘤病毒16 腺病毒载体种子库

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陈刚

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