方风琴
- 作品数：10 被引量：21H指数：2
- 供职机构：上海交通大学医学院附属瑞金医院更多>>
- 发文基金：上海市科委重大科技攻关项目上海市科学技术委员会基础研究重点项目国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人巨细胞病毒UL97基因耐药重组株的构建与鉴定
- 2009年
- 目的构建含UL97基因耐药相关突变的重组人巨细胞病毒（rHCMV），并通过耐药表型和基因型加以鉴定。方法采用重叠延伸剪接PCR在UL97基因中引入PineI位点和耐药相关位点做定点突变，将所获突变基因片段按比例与人巨细胞病毒（HCMV）AD169标准株DNA混合，经脂质体介导共转染成纤维细胞MRC-5。利用间接免疫荧光检测HCMVPP65抗原，证实MRC-5已被rHCMV感染，观察同源重组病毒形成的细胞病变达100％后收获该重组病毒。用不同浓度更昔洛韦进行噬斑筛选纯化目的病毒，并通过噬斑减少试验和耐药基因（UL97和UL54）序列分析对重组病毒进行鉴定。结果成功构建目的突变UL97基因片段，同病毒基因组DNA共转染7d后可见明显细胞病变，PP65抗原检测证实为rHCMV感染灶。经过克隆筛选得到的重组病毒株UL97基因型分析结果与预期一致，UL54基因测序未发现突变。阳性克隆重组病毒对更昔洛韦敏感性显示半数抑制浓度（IC50）为15μmol／L，是标准株的12倍，具耐药表型。结论成功将HCMV基因组DNA与耐药突变目的基因片段共转染MRC-5细胞，通过更昔洛韦筛选和噬斑纯化获得目的重组病毒株。该方法的建立为在用药过程中不断出现的新的HCMV耐药突变株的鉴定分析提供了有效的技术平台。
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- 关键词：巨细胞病毒病毒点突变病毒转染
- 人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部结构模拟和突变分析
- 2010年
- 目的初步探索人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部序列(329～572aa)的三维模拟结构并进行突变的耐药分析。方法采用巢式PCR方法扩增UL97基因776 bp片段并测序,以此发现非同义突变;然后利用SWISS-MODEL结构模拟综合服务器和其他相关软件比对模式对野生型PUL97蛋白片段进行同源模建并优化,通过各种指标或服务器来评估模拟结构的优劣并作筛选。将筛选所得的最佳模拟结构用于非同义新突变型的初步耐药分析。结果最终筛选出的模拟结构是以1YDTE为模板,以L1.FASTA为比对文件所得的Model A。整个分子的能量最低,ProQ的预测分数最高。分子对接分析也发现了潜在的ATP和GCV结合口袋。利用已知的阴阳性耐药点突变验证了该结构的合理性。同时根据突变前后结构信息的改变,提示C518Y单点突变以及联合突变(E517G和C518Y)呈现高度可疑的耐药特性。结论 PUL97野生型蛋白计算机结构模拟和突变分析法是初步评估新突变型耐药特性的又一方便快捷的方法 ,可用于实验验证前的筛选;但模拟结构本身的准确性是成功运用该方法的前提。
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- 关键词：人巨细胞病毒突变分析
- 人巨细胞病毒潜伏-激活研究的新进展被引量：15
- 2010年
- 方风琴季育华
- 关键词：人巨细胞病毒沉默PP65抗原血症
- 外周血白细胞中人巨细胞病毒pp65抗原的定位及意义被引量：1
- 2008年
- 目的明确人巨细胞病毒(HCMV)磷酸基质蛋白65(pp65)抗原在阳性细胞中的定位并初探其定位与病毒活动间的关系,为指导临床病毒抗原血症的监测提供依据。方法利用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料能与细胞双链DNA结合的特点,在激光共聚焦显微镜下对HCMV pp65单抗阳染细胞进行抗原定位;同时通过外周血白细胞与病毒共培养技术,检测分析其定位与病毒活动的关系。结果临床标本检测的HCM- Vpp65抗原阳染细胞的表现形式有3种,即细胞浆型、细胞核型和细胞浆核混合型,其中细胞核中的HCMV pp65抗原聚集于细胞核的内部,而非仅仅附着于核表面。进一步的白细胞与病毒共培养结果显示,只有野生型病毒株感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)与外周血白细胞共培养,才能检出HCMV pp65抗原阳性的白细胞,而且表现为仅初期(培养1 h内)可检出细胞浆阳染型,随着时间延长,约80%～90%的抗原阳染白细胞表现为细胞核型,偶见细胞浆核混合型。结论HCMV pp65抗原血症时阳染的外周血白细胞的表现形式有3种,即细胞核型、细胞浆型以及细胞浆核混合型,其中细胞核型属细胞核内部型,并非细胞核表面附着型。结合共培养结果认为,细胞核型阳染细胞的检出更能提示病毒的活动。
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- 关键词：人巨细胞病毒共聚焦显微镜白细胞外周血
- 不同核酸提取法对HCMV-DNA准确定量的影响被引量：2
- 2006年
- 目的评价不同核酸提取法对人巨细胞病毒核酸(HCMV-DNA)荧光定量PCR准确定量的影响。方法含HCMVAD169株病毒颗粒的病毒培养物,以不同浓度分别与10份健康人HCMV-DNA阴性血浆标本混合;另取15份临床移植患者HC-MVpp65抗原血症阳性血浆样本,上述2种标本分别用碱裂解吸附法、沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿抽提法提取病毒核酸模板,随后运用荧光定量聚合酶链反应对样本进行定量分析,并作评价。结果15例临床检测阳性血浆标本中,酚-氯仿法提取效率为最高(P<0.05),换算后其相对提取效率为100%,而沉淀煮沸裂解法为90%,碱裂解吸附法为65%;此外,沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿法的重复性均好于碱裂解吸附法,变异系数(CV)值分别为0.26、0.30和0.39。结论经典、传统的酚-氯仿抽提法仍不失为实验室首选的核酸提取方法。
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- 关键词：核酸荧光定量PCR人巨细胞病毒
- 流式细胞术检测分析人巨细胞病毒核酸疫苗诱导宿主细胞免疫效应
- 2007年
- 目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)pp65核酸疫苗对宿主细胞免疫功能的诱导效应。方法用自行构建的含HCMVpp65基因的重组质粒免疫小鼠,用流式细胞仪检测免疫小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的变化以及CD8+T细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素(IL)-4的情况,并以四甲基偶氮唑盐(MTT)增殖试验作补充验证。结果接种重组质粒组与仅接种空质粒或生理盐水对照组小鼠的免疫效应不同,表现为CD8+T细胞百分率增加(P<0.05),分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的CD8+T细胞百分率亦增高(P<0.05),两者的平均荧光强度值增高更为显著(P<0.05)。免疫小鼠的脾脏T细胞经HCMVpp65蛋白刺激后,实验组的刺激指数(SI)较对照组明显增高(P<0.05)。结论HCMVpp65核酸疫苗接种可诱导宿主的细胞免疫反应,倾向于表现为细胞毒性T细胞(Tc)1和Tc2的混合应答以及脾脏T细胞的增殖效应。
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- 关键词：PP65人巨细胞病毒特异性细胞免疫流式细胞术
- 人巨细胞病毒对更昔洛韦耐受性的基因型鉴别方法的建立和应用被引量：1
- 2009年
- 目的建立实验室检测人巨细胞病毒(HCMV)更昔洛韦(GCV)耐药的基因型分析的常规方法。方法采用巢式聚合酶链反应(PCR)直接扩增33例HCMV感染患者的外周血白细胞及前期实验同步获得的33例临床分离毒株的HCMV UL97基因片段,对扩增产物进行测序,与HCMV标准毒株AD169序列比对,参照国外报道的耐药相关的热点突变,判定各临床分离毒株的耐药基因型。结果除有1株为HCMV UL97呈M460V突变型外,余32株同标准株AD169的序列一致。同一患者的分离毒株与外周血白细胞中测得HCMV UL97基因序列完全一致。结论建立的实验室检测HCMV耐药的基因型分析完全可以替代传统的耐药表型分析,前者无需分离活病毒,不仅需时短,而且相对安全,其技术要点更适宜临床推广应用。
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- 关键词：人巨细胞病毒更昔洛韦耐药基因型
- 人巨细胞病毒临床分离株对更昔洛韦耐药的表型分析被引量：2
- 2009年
- 目的检测分析人巨细胞病毒(HCMV)临床分离株的更昔洛韦(GCV)耐药表型。方法收集临床接受GCV治疗过的各类移植受体的血液或尿液标本以及婴幼儿HCMV感染症患儿的尿液标本,分离HCMV。然后通过噬斑减少试验测试其对GCV药物的耐受性。病毒株对GCV的耐受性程度表示以不加药物孔中病毒致细胞病变效应(CPE)为参照,能够抑制50%CPE的药物浓度(IC50)为GCV的耐受性。GCV敏感型毒株的IC50为≤5.000μmol/L。结果以标本接种人胚肺成纤维细胞(MRC-5),最终获得病毒株共33株。其中6株来自移植受体,27株来自婴幼儿HCMV感染症患儿。以MRC-5为敏感细胞,调整所测病毒浓度为100×50%组织培养感染量(TCID50),并加入不同浓度的GCV药物,检测发现32株GCV的IC50均≤5.000μmol/L(1.500～5.000μmol/L),只有1株GCV IC50为12.500μmol/L。同步平行检测的标准毒株HCMV AD169的GCV IC50为1.500μmol/L。结论药物耐受表型测定能够了解并评估病毒对GCV药物的敏感与否,但全过程周期较长,技术要求比较高,尤其必须以获得活病毒为前提,尚难以直接推向临床实验室。
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- 关键词：人巨细胞病毒更昔洛韦表型药物敏感性
- 定量聚合酶链反应评估去白细胞滤器去除血液成分中巨细胞病毒的效果
- 2009年
- 为了评估目前常用的去白细胞滤器去除血液成分中人巨细胞病毒(HCMV)的效果,我们在献血员中筛选获得HCMV-IgG、pp65皆阴性的血液,分离外周血单个核细胞(PBMC),将HCMV感染的人成纤维细胞与PBMC共培养,感染HCMV的PBMC经抗人成纤维抗体和抗CD45磁珠2次分选纯化后,将CD45+单核细胞加回原全血中,建立HCMV潜伏感染的模型,再用去白细胞滤器过滤。用实时聚合酶链反应(PCR)定量测定过滤前、后血液样本中的病毒载量,残留成纤维细胞所含的HCMV通过定量反转录PCR(RT-PCR)扩增脯-4-羟化酶exon12a mRNA来校正。结果显示,使用去白细胞滤器后,每单位(200ml)全血血液中,白细胞的去除率为99.98%。全血中平均HCMV病毒载量从3742拷贝/μl降至22.57拷贝/μl,降低2.50log10,说明去白细胞滤器虽然可明显减少全血中HCMV病毒的载量,但并不能完全去除病毒。
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- 关键词：巨细胞病毒去白细胞滤器成纤维细胞
- 多形核白细胞中HCMV-pp65蛋白的定位及对移植群体的意义
- 目的：对临床检测发现的HCMV pp65阳性外周血多形核白细胞不同表现形式作定位分析及与临床病症、病程的关系。方法：运用能与细胞核结合的染料DAPI染色结果与免疫荧光染色的叠加,分析确定HCMVpp65抗原在细胞内的位置...
- 章莉张玥方风琴季育华
- 关键词：多形核白细胞人巨细胞病毒抗原血症
- 文献传递
