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内皮祖细胞移植对大鼠肝硬化作用的研究被引量：3: 2009年; 目的探讨内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）移植对四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导的大鼠肝硬化的作用。方法本组38只SD大鼠中8只大鼠为正常对照，其余30只采用25％的CCl4／橄榄油灌胃制备肝硬化模型。再将肝硬化大鼠分为3组，每组10只。12周后直接处死的为肝硬化模型组，门静脉输入大鼠EPCs为EPCs移植组，经门脉输入生理盐水为移植对照组。移植4周后检测移植组和移植对照组大鼠肝组织胶原Ⅲ（collagen Ⅲ，COL Ⅲ）、平滑肌动蛋白（smooth muscle actin α，α—SMA）和Ki67的表达，检测外周血肝功能和血凝分析。结果肝硬化模型组大鼠肝脏体积增至正常时的2倍。EPCs移植组大鼠与肝硬化模型组比较，肝组织学活动指数（histological activity index，HAI）（F=75．062，P〈0．01），丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）（F=29．942，P〈0．05），门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）（F=16．618，P〈0．05）和总胆红素（total bilirubin，TBIL）（F=9．911，P〈0．05）水平降低，白蛋白（albumin，Alb）（F=4．944，P〈0．05）和Ki67（F=45．966，P〈0．01）水平升高，纤维化面积（F=25．025，P〈0．05）减少，α—SMA（F=7．86，P〈0．05）和COL Ⅲ（F=135．787，P〈0．01）表达降低；与正常肝脏相比，移植对照组HAI，ALT，AST和TBIL水平升高，Alb和Ki67水平降低，纤维化面积增加，α—SMA和COL Ⅲ表达升高（P〈0．05）。移植对照组大鼠凝血酶原时间延长，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论移植EPCs可以促进大鼠肝硬化的肝细胞增生，减轻肝纤维化程度。; 刘峰刘志达武楠丛旭费然陈红松魏来; 关键词：肝硬化干细胞

干扰素-β-1a对人肝星状细胞系LX-2蛋白质组的影响: 目的观察干扰素-β-1a(interferon-beta-1a,IFN-β-1a)作用于人肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)系 LX-2后的蛋白质组学差异,从而发现 IFN-β-1a抑制肝...; 饶慧瑛王江华刘峰费然刘志达魏来; 文献传递

粒细胞集落刺激因子动员对大鼠内皮祖细胞体外扩增的影响被引量：2: 2008年; 背景：内皮祖细胞在缺血性疾病治疗应用中存在数量低的问题，许多细胞因子影响其动员效果和功能。目的：观察粒细胞集落刺激因子动员对体外扩增骨髓源性内皮祖细胞数量及功能的影响。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-08／2008—03在北京大学人民医院肝病研究所完成。材料：SPF级健康成年SD雄性大鼠16只，随机分为动员组和对照组，8只／组。重组人粒细胞集落刺激因子为麒麟鲲鹏生物药业有限公司产品。方法：实验前动员组大鼠皮下注射经生理盐水稀释的重组人粒细胞集落刺激因子10ug／kg，2次，d，共5d。采用密度梯度离心法分别从两组大鼠骨髓获取单个核细胞，洗涤后按2×10^7／孔接种在包被大鼠纤连蛋白的6孔板上，采用贴壁法纯化得到内皮祖细胞。主要观察指标：骨髓单个核细胞集落数及细胞表型，骨髓源性内皮祖细胞贴壁情况及细胞表型，通过DiI-acLDL摄取、体外血管生成进行内皮祖细胞功能学鉴定，透射电镜观察细胞超微结构。结果：与对照组比较，动员组骨髓单个核细胞集落增多，CD45^＋／CD34^＋、CD133^＋和Flk-1^＋阳性率均明显升高（F=5．655～61．892，P〈0．05）。培养第7，9天与对照组比较，动员组骨髓源性内皮祖细胞贴壁数、CD45^＋／CD34^＋、CD133^＋和Flk-1^＋阳性率均明显升高（F=5．694～38．879，P〈0．05）。贴壁细胞F1TC—UEA-1／Dil—acLDL双荧光染色阳性率为90％，接种于Matrigel包被的培养板24h后形成毛细血管索样结构，胞质内有Weibel—Palade小体存在。结论：粒细胞集落刺激因子动员能增加骨髓源性内皮祖细胞的数量，并促进其分化、增殖功能。; 刘峰刘志达武楠丛旭费然魏来; 关键词：粒细胞集落刺激因子内皮祖细胞扩增

PKH26荧光标记大鼠内皮祖细胞在慢性损伤肝内迁移示踪: 2009年; 背景:课题组早期研究发现门静脉回输内皮祖细胞可以改善肝纤维化,但是将其应用于临床尚有很多问题需要解决,如回输路径、细胞的分布情况等。目的:探讨PKH26荧光标记的大鼠内皮祖细胞在慢性肝损伤肝内迁移过程中的示踪。设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2008-08/2009-02在北京大学人民医院肝病研究所完成。材料:SPF级健康成年SD大鼠100只,由解放军军事医学科学院动物中心提供。红色荧光染料PKH26为SIGMA公司产品。方法:取16只大鼠,贴壁法分离培养内皮祖细胞,并行PKH26体外标记。实验设立3组:正常对照组4只大鼠,不进行任何干预;二甲基亚硝胺组40只大鼠,通过腹腔注射二甲基亚硝胺10mg/kg建立肝纤维化模型;四氯化碳组40只大鼠,通过四氯化碳/橄榄油灌胃建立肝纤维化模型。造模后,二甲基亚硝胺组、四氯化碳组大鼠经尾静脉注入1mLPKH26标记的内皮祖细胞悬液(1×106个细胞)。主要观察指标:PKH26标记率和细胞存活率,通过荧光共聚焦显微镜观察大鼠损伤肝内内皮祖细胞的迁移及CD31的表达。结果:流式细胞仪检测结果显示PKH26标记的内皮祖细胞阳性率为99%,荧光显微观察发现锥虫蓝染色后PKH26标记细胞存活率均>90%。输注1d后,两种慢性肝损伤模型中的肝内均可见PKH26标记阳性的细胞出现在肝小叶内,并且随时间延长阳性细胞数增加。PKH26标记阳性的细胞主要存在于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的窦内皮,且血管内皮可见CD31/PK26双阳性细胞。结论:PKH26可以在体外成功标记大鼠内皮祖细胞,并在损伤肝内示踪。; 刘峰刘志达武楠丛旭费然陈红松魏来; 关键词：PKH26 内皮祖细胞示踪

大鼠内皮祖细胞的培养及鉴定被引量：4: 2007年; 目的：探索大鼠内皮祖细胞的分离培养，为缺血性疾病细胞移植治疗提供实验方法。方法：采集大鼠骨髓，梯度密度离心法分离单核细胞，内皮细胞培养液M199培养基培养（含20％FCS＋15ng／ml VEGF），种植于提前包埋了纤维连接蛋白的六孔板培养，应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志：CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133。并通过检测其对FITC标记的UED-1的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定。结果：经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1，部分表达CD133。大鼠骨髓单个核细胞经体外诱导分化，培养第5～14天的贴壁细胞不同程度的表达CD34、CD31、Flk-1和CD31。培养第9天流式细胞仪检测其阳性率分别为（40．12±6．28）％、（15.62±4．31）％、（44．05±8．20）％和（76．1±7．20）％，细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL，并且在Matrigel上可以形成毛细血管样。结论：大鼠骨髓可以分离培养内皮祖细胞并能体外扩增，为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础。; 刘峰费然丛旭刘志达魏来; 关键词：内皮细胞细胞培养技术

终末期肝病患者乙型肝炎病毒感染与肝祖细胞激活的关系被引量：1: 2008年; 目的探讨终末期肝病患者乙型肝炎病毒感染与祖细胞激活和扩增的关系。方法 16例终末期慢性乙型肝炎患者的肝活检标本,以细胞角蛋白(CK7)为标记做免疫组织化学,定量分析祖细胞数目和胆管反应面积的相关性。结果全部患者均从组织学证实为肝硬化,并且炎症反应严重(炎症活动度评分12～17分)。祖细胞数目和胆管反应面积呈显著正相关。血清HBVDNA水平与祖细胞数目和胆管反应面积均显著相关。结论在终末期慢性乙型肝炎患者中,祖细胞的激活和扩增明显,HBV感染可能参与肝祖细胞的激活和扩增。; 武楠刘峰马慧刘志达费然陈红松王豪魏来; 关键词：终末期肝病乙型肝炎病毒

神经胶质成熟因子β对肝星状细胞活化和肝纤维化的影响被引量：1: 2007年; 目的了解IFN β-1a抑制肝星状细胞活化新的作用分子，并进一步验证该分子与HSC活化和肝纤维化的关系。方法LX-2细胞经2000U／ml IFN β-1a处理48h后，采用二维电泳技术对IFN β-1a处理和未处理的LX-2细胞蛋白质进行分离，质谱鉴定IFN β-1a处理前后LX-2细胞中差异表达超过2倍的蛋白点。对于鉴定出的差异表达分子，通过Western blot和RT-PCR方法验证其在LX-2细胞中、肝组织中以及肺、脑、脾、肾、心组织中的表达情况。结果与对照组相比，IFN—β-1a处理组LX-2细胞中有31个差异蛋白点，其中1个特异表达、5个上调表达、25个下调表达。其中特异表达的蛋白经鉴定为神经胶质成熟因子β（GMFβ）；表达上调的5个点鉴定出2种蛋白，为组蛋白H2A和β-原肌球蛋白；表达下调的25个点鉴定出18种蛋白。进一步对GMFβ的表达情况进行验证发现，与对照组相比，经IFN β-1a作用后的LX-2的GMF β蛋白表达明显（t=1．81，P〈0．01）；大鼠正常肝组织中GMFβ的蛋白和mRNA相对表达量明显高于肝硬化肝组织（蛋白相对表达量为1．81对比0．10，mRNA相对表达量为0．85对比0．12，t值分别为2．53，2．13，P〈0．01）；GMFβ的蛋白和mRNA在大鼠的脑、脾、肝、肾组织中明显表达，而肺、心组织中无表达（t值分别为1．91、1．94，P〈0．01）。结论IFN β-1a处理后的LX-2的蛋白质表达存在差异，这些差异表达的蛋白质可能参与了IFN β-1a对HSC活化的抑制以及HSC的凋亡。IFN β-1a处理后的LX-2以及正常大鼠的肝组织中GMFβ有明显的表达，GMFβ可能抑制HSC的活化以及抑制肝纤维化的进展。; 饶慧瑛王江华刘峰费然刘志达魏来; 关键词：蛋白质组干扰素Β 肝星状细胞

乙型肝炎肝硬化患者肝组织中肝脏祖细胞激活特征的研究: 2008年; 目的观察肝脏祖细胞(hepatic progenitor cells,hpcs)在乙型肝炎肝硬化患者肝组织中的激活特征,探讨hbv感染是否影响hpcs的激活.方法以细胞角蛋白(ck7)为标记,对16例乙型肝炎肝硬化患者的肝组织做免疫组织化学染色,定量分析hpcs数目及胆管反应面积.hbsag和hbcag染色,观察两种病毒蛋白的表达与hpcs激活的关系.结果乙型肝炎肝硬化患者肝组织中hpcs激活程度高,胆管反应明显.肝组织中hbsag的表达与hpcs激活程度呈正相关.结论在乙型肝炎肝硬化患者的肝组织中,hpcs被明显激活和扩增,hbv感染可能参与hpcs的激活. abstract： objective to observe the characteristics of hepatic progenitor cells(hpcs)activation in liver tissues of patients with hepatitis b cirrhosis,and to investigate the relationship between the number of hpcs and hbv infection.methods cytokeratin 7(ck7)-was stained immunohistochemically in liver tissues of 16 patients with hepatitis b cirrhosis.hpcs and duetular reactions were quantitively analyzed.the expression of hbsag and hbcag were also detected to evaluate its relationship with hpcs activation.results hpcs were extensively activated and marked duetular reactions can be observed in cirrhotic liver tissues.tlle expression of hbsag was positively correlated with hpcs activation.conclusions hpcs are extensively activated in cirrhotic liver tissues,and hbv infection may facilitate its activation.; 武楠刘峰马慧朱凤雪刘志达费然陈红松王豪魏来; 关键词：肝硬化

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刘志达

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