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龚秀芳: 作品数：17 被引量：43H指数：4; 供职机构：中国药科大学药学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金南京军区医学科技创新课题江苏省自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>

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2型猪链球菌89K毒力岛Ⅳ型分泌系统LAMP检测方法的建立被引量：10: 2014年; 目的建立针对高致病性2型猪链球菌（Streptococcus suis 2，SS2）89K毒力岛Ⅳ型分泌系统的环介导等温扩增（100p-mediated isothermal amplification，LAMP）方法。方法根据国内流行株特有89K毒力岛编码的Ⅳ型分泌系统（T4SS-89K）的virB4-89K基因保守区域设计并合成LAMP引物，通过优化反应体系和扩增条件建立T4SS-89K快速检测方法，对方法的特异性、敏感性进行评估。结果优化的LAMP反应体系具有良好的扩增效率，检测灵敏度为1．53×10^-1拷贝／反应，全部扩增检测可在60rain内完成；建立的LAMP法具有良好的特异性，与不含T4SS-89K的猪链球菌（包括1／2型、1型、3-33型），以及其他常见9种对照菌均不发生特异性扩增，而与1998和2005年疫情现场分离的高致病性SS2均可发生特异性扩增。结论建立的LAMP方法具有特异、灵敏，设备要求简单等特点，可用于高致病性SS2快速检测。; 张凤玉胡丹吕恒张锦海郝丽娜龚秀芳操敏郑峰耿美玲朱进李丙军潘秀珍王长军

2型猪链球菌磷酸甘油酸激酶基因的克隆表达及酶活性测定被引量：1: 2018年; 目的：克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶（PGK）并对其酶学特性进行测定。方法：采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒p ET28a：pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coli BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDSPAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。结果：PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43k Da的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75U/ml,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744mmol/L,Vmax为0.143mmol/（L·min）,相对于ATP的Km值为2.266mmol/L,Vmax为0.318mmol/（L·min）。结论：利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。; 郭晓璐龚秀芳陈家锋丁晨曦胡丹潘秀珍王长军; 关键词：2型猪链球菌克隆表达酶活性

2型猪链球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶基因的克隆表达及酶活性测定被引量：1: 2017年; 目的:克隆表达2型猪链球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)的编码基因,并测定其酶活性。方法:根据GenBank中05ZYH33基因组序列设计引物,PCR扩增NagA(SSU05_1259)基因,将其克隆到pET28a载体中,构建重组质粒pET28a:NagA,转化至大肠杆菌BL21,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE与质谱鉴定;利用Ni亲和层析柱对表达产物进行纯化,获得NagA重组蛋白后测定其酶活性。结果:在大肠杆菌中高效表达了NagA基因,重组表达的Nag A相对分子质量约为43×10~3,其酶促反应最适温度为37℃,最佳反应时间为30min,最适反应pH值为7.5,最佳底物浓度为13mmol/L。2型猪链球菌NagA的体外酶活为124U/mL,酶比活为78U/mg。结论:在原核系统中表达了NagA基因,获得的NagA蛋白具有良好的酶学活性。; 钱思彤龚秀芳唐慧娴王依潘秀珍王长军; 关键词：2型猪链球菌原核表达酶活性

恙虫病东方体合肥分离株截短56kDa蛋白抗原表达及活性分析: 2014年; 本文获得恙虫病东方体合肥分离株截短56kDa外膜蛋白基因工程纯化抗原，并鉴定其免疫学活性，为进一步研制广谱诊断试剂、疫苗以及分析其在东方体致病的分子机制奠定基础。我们通过DNA Star和Mega等软件对含有440个氨基酸的合肥株56kDa蛋白序列进行抗原性分析；将合肥株56kDa截短蛋白基因克隆至原核表达载体pET28a获重组质粒，转入大肠杆菌E．coli BL21感受态中，经IPTG诱导，SDS—PAGE电泳分析检测蛋白表达；采用亲和层析法纯化目的蛋白，Western-blot及ELISA法鉴定其免疫学活性。序列分析发现合肥分离株56kDa蛋白可分为4个保守区和3个可变区，抗原性分析结果显示，其保守区的亲水性和抗原性均有很高峰值。SDS—PAGE电泳显示约56kDa的目的重组蛋白表达条带，Western—blot分析显示该重组蛋白可与恙虫病病人血清反应，阴性血清则未出现相应印迹，ELISA分析结果显示该蛋白最低浓度为80ng／μL时仍可检出阳性血清；5μg／mL蛋白可检测阳性血清滴度高达1：12800，证实其具有较强反应原性。本实验获得恙虫病东方体合肥株56kDa截短外膜蛋白基因工程抗原具有良好的抗原活性，有望进一步应用于恙虫病的诊断、疫苗研制及致病机制分析。; 耿美玲郑峰吕恒朱进胡丹郝丽娜张凤玉龚秀芳李丙军李先富潘秀珍王长军操敏; 关键词：恙虫病东方体抗原性基因表达

汉坦病毒S基因的克隆及体外转录被引量：2: 2014年; 目的:通过基因克隆和体外转录,获得汉坦病毒汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的RNA全长cRNA,为汉坦病毒病原学检测提供阳性定量标准品。方法:设计汉滩型76118株和汉城型R22株S基因克隆引物,PCR获得相应片段,分别克隆至含双启动子的PCRⅡ载体中,测序鉴定无误后,重组质粒分别经内切酶SpeⅠ、SacⅠ线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物经DNase处理、纯化后测定浓度,经RT-PCR验证。结果:获得汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的cRNA片段,并可准确定量其拷贝数,76118株和R22株的质量浓度分别为80、17.58 ng/μL。结论:获得的cRNA样品可作为汉坦病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。; 郝丽娜胡丹吕恒张锦海张凤玉龚秀芳李丙军朱进潘秀珍姚苹苹张云王长军陈建华; 关键词：汉坦病毒克隆体外转录

2型猪链球菌MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除突变体的构建及毒力分析被引量：2: 2015年; 目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33中MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除的突变株,探索SSU0562基因缺失对细菌基本生物学特性和毒力的影响。方法:构建左右两侧为SSU0562基因上下游的同源序列,中间部分为壮观霉素抗性基因(Spcr)的基因敲除质粒,通过同源重组的方法筛选SSU0562基因敲除突变株Δ0562。对突变株与野生株的基本生物学特性进行系统的比较分析,并且将小鼠作为动物感染的模型来研究突变株的毒力。结果:组合PCR的分析及基因测序结果均表明Spcr完全取代了S.suis2中SSU0562基因位点,表明基因敲除突变体Δ0562构建成功,反转录PCR(RT-PCR)证实了突变株Δ0562中SSU0562基因在转录水平的缺失;在溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力方面,突变株Δ0562与野生株05ZYH33相比均无显著差别,然而革兰染色实验显示突变株Δ0562的成链能力明显减弱。结论:猪链球菌强毒株05ZYH33的毒力并未因SSU0562基因的缺失而发生显著性改变,表明SSU0562基因并非猪链球菌的毒力决定因子,但很有可能参与猪链球菌成链能力的调控。; 李娟刘丽娜胡丹朱旭辉龚秀芳赵琳钟璟皓潘秀珍王长军; 关键词：2型猪链球菌

猪链球菌cAMP结合蛋白基因敲除株的构建及生物学特性: 2015年; 目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33 c AMP结合蛋白(CRP)编码基因敲除突变株及基因回复互补株,并探究CRP基因的缺失对细菌生物学特性及毒力的影响。方法:构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr)、两侧为CRP编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选CRP编码基因敲除突变株ΔCRP;构建CRP编码基因的互补质粒,通过电转化敲除株ΔCRP,筛选CRP的基因回复互补株CΔCRP;比较分析突变株、野生株和回复互补株的基本生物学特征的差异,并以小鼠作为动物感染模型对突变株、互补株及野生株的毒力进行评估分析。结果:应用组合PCR和基因测序分析,证实构建了CRP的突变株ΔCRP,并筛选出CRP的回复互补株CΔCRP;逆转录PCR证实在突变株ΔCRP中CRP在转录水平缺失,而在回复互补株CΔCRP中其转录回复;在丰富营养情况下,突变株ΔCRP与野生株的溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力均无显著性差异,但突变株的成链能力减弱。结论:CRP编码基因的缺失并未显著改变野毒株05ZYH33的基本生物学特性和毒力,提示CRP可能不是猪链球菌的关键毒力决定因子,其参与碳源代谢等功能有待进一步研究。; 赵琳胡丹钟璟皓李娟龚秀芳潘秀珍王长军陈建华; 关键词：猪链球菌突变株毒力

2型猪链球菌SSU0448基因敲除突变株的构建及其毒力分析被引量：2: 2015年; 【目的】通过构建2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33的SSU0448基因缺失突变株Δ0448和互补株CΔ0448,探索SSU0448基因缺失对细菌基本生物学特性和细菌毒力的影响。【方法】用同源重组基因敲除方法构建筛选强毒株05ZYH33中N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢途径相关转录调节因子SSU0448基因的缺失突变株,比较分析突变株Δ0448与野生株05ZYH33、互补株CΔ0448的基本生物学特性,小鼠毒力实验分析SSU0448基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】PCR检测分析显示,SSU0448基因在转化重组体中被壮观霉素抗性基因所替代,表明基因敲除突变株构建成功;同时构建了基因功能互补株CΔ0448。生物学特性实验表明突变株Δ0448在成链能力上较野生株明显减弱,对数生长期稍短,快速到达平台期;而菌落形态、革兰氏染色和溶血活性方面无明显差异;小鼠毒力实验发现,突变株毒力并无显著改变。【结论】SSU0448基因的敲除能够改变2型猪链球菌的成链能力;不影响其侵袭致病能力,可能延缓2型猪链球菌的发病过程,此研究为2型猪链球菌致病感染奠定了基础。; 龚秀芳胡丹朱旭辉李娟赵琳钟璟皓潘秀珍王长军; 关键词：2型猪链球菌基因敲除毒力

寨卡病毒prM蛋白原核表达及其多克隆抗体制备被引量：2: 2018年; 目的通过原核表达系统表达纯化寨卡病毒(zika virus,ZIKV)prM膜蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。方法在对寨卡病毒膜蛋白prM进行生物信息学分析的基础上,去除其跨膜域,对该蛋白的密码子进行优化,化学合成基因序列并连接到表达质粒pET32a,重组质粒转化E.coli.BL21(DE3),并对其进行测序,然后进行原核诱导表达,诱导产物进行SDS-PAGE鉴定并用His柱纯化。纯化的重组蛋白用于免疫BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法和Western blot检测血清抗体效价及特异性。结果原核表达系统成功表达了截短prM蛋白,相对分子质量(Mr)为37×10~3,与预期相符。经过His柱纯化后获得高纯度的目的蛋白;该蛋白免疫BALB/c雌鼠后诱导产生特异性多克隆抗体,ELISA效价为1∶819 200;Western blot显示制备的多克隆抗体能性识别prM蛋白。结论利用原核表达系统高效表达并纯化了prM膜蛋白,制备的多克隆抗体效价高,特异性强,为进一步研究该病毒的致病机制及建立ZIKV感染快速诊断方法奠定了基础。; 陈家锋丁晨曦郭晓璐胡丹龚秀芳叶福强艾乐乐王长军; 关键词：多克隆抗体

2型猪链球菌SrtA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定被引量：2: 2017年; 目的制备并鉴定2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)强毒株05ZYH33分选酶A(Sortase A,SrtA)的单克隆抗体。方法 PCR扩增2型猪链球菌05ZYH33菌株基因组SrtA全长,构建表达质粒pETDuet-1/SrtA,导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达SrtA蛋白,柱纯化后免疫BALB/c雌鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,收集培养上清并制备小鼠腹水,采用Western blot单克隆抗体特异性,ELISA检测单抗效价。结果筛选到1株能持久、稳定分泌抗SrtA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,标记为1F5,抗体亚型为IgM型/κ链;Western blot显示该抗体能识别SrtA蛋白。结论成功制备分泌抗SrtA蛋白的杂交瘤细胞株,制备的单抗效价高,为研究2型猪链球菌感染致病过程中SrtA的作用奠定了基础。; 丁晨曦艾乐乐龚秀芳胡丹胡丹郭晓璐潘秀珍潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌 SORTASE 原核表达单克隆抗体

龚秀芳

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