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郝丽娜: 作品数：10 被引量：30H指数：3; 供职机构：中国人民解放军南京军区军事医学研究所更多>>; 发文基金：国家自然科学基金江苏省自然科学基金江苏省科技支撑计划项目更多>>; 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>

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2型猪链球菌菌毛结构亚蛋白tSSU0473的原核表达与免疫学特性研究被引量：1: 2013年; 目的:探究2型猪链球菌(S.suis2)强毒株05ZYH33的srtF基因簇编码的菌毛结构亚蛋白SSU0473的细菌定位及其免疫保护效能。方法:原核表达截短的SSU0473(tSSU0473),并以亲和层析法纯化目的蛋白,Western印迹检测tSSU0473蛋白的免疫原性,ELISA法检测多抗血清的效价及IgG亚型,小鼠试验测试重组蛋白的免疫保护效能,免疫电镜观测tSSU0473蛋白的细菌定位。结果:在原核系统中表达了tSSU0473蛋白;ELISA结果显示重组蛋白能够刺激小鼠产生高效价的免疫抗体;动物试验表明tSSU0473蛋白免疫小鼠可抵御致死剂量病原体的攻击,显示出较好的免疫保护作用;免疫电镜检测显示tSSU0473蛋白定位于细菌表面。结论:菌毛亚蛋白tSSU0473是S.suis2膜表面蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性,可作为S.suis2亚单位疫苗的候选分子。研究结果为系统揭示S.suis2的菌毛生物学结构与功能奠定了基础。; 胡丹张先云耿美玲张凤玉郝丽娜朱静郑峰潘秀珍王长军; 关键词：2型猪链球菌菌毛原核表达免疫保护

2型猪链球菌89K毒力岛Ⅳ型分泌系统LAMP检测方法的建立被引量：10: 2014年; 目的建立针对高致病性2型猪链球菌（Streptococcus suis 2，SS2）89K毒力岛Ⅳ型分泌系统的环介导等温扩增（100p-mediated isothermal amplification，LAMP）方法。方法根据国内流行株特有89K毒力岛编码的Ⅳ型分泌系统（T4SS-89K）的virB4-89K基因保守区域设计并合成LAMP引物，通过优化反应体系和扩增条件建立T4SS-89K快速检测方法，对方法的特异性、敏感性进行评估。结果优化的LAMP反应体系具有良好的扩增效率，检测灵敏度为1．53×10^-1拷贝／反应，全部扩增检测可在60rain内完成；建立的LAMP法具有良好的特异性，与不含T4SS-89K的猪链球菌（包括1／2型、1型、3-33型），以及其他常见9种对照菌均不发生特异性扩增，而与1998和2005年疫情现场分离的高致病性SS2均可发生特异性扩增。结论建立的LAMP方法具有特异、灵敏，设备要求简单等特点，可用于高致病性SS2快速检测。; 张凤玉胡丹吕恒张锦海郝丽娜龚秀芳操敏郑峰耿美玲朱进李丙军潘秀珍王长军

用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法: 本发明涉及一种用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法。该引物包括HTNV引物组和SEOV引物组，两引物组分别包括外引物对，内引物对，以及环引物对，其序列如SEQ？ID？NO:3-14所示。该...; 王长军胡丹张锦海郝丽娜吕恒谭维国; 文献传递

恙虫病东方体合肥分离株截短56kDa蛋白抗原表达及活性分析: 2014年; 本文获得恙虫病东方体合肥分离株截短56kDa外膜蛋白基因工程纯化抗原，并鉴定其免疫学活性，为进一步研制广谱诊断试剂、疫苗以及分析其在东方体致病的分子机制奠定基础。我们通过DNA Star和Mega等软件对含有440个氨基酸的合肥株56kDa蛋白序列进行抗原性分析；将合肥株56kDa截短蛋白基因克隆至原核表达载体pET28a获重组质粒，转入大肠杆菌E．coli BL21感受态中，经IPTG诱导，SDS—PAGE电泳分析检测蛋白表达；采用亲和层析法纯化目的蛋白，Western-blot及ELISA法鉴定其免疫学活性。序列分析发现合肥分离株56kDa蛋白可分为4个保守区和3个可变区，抗原性分析结果显示，其保守区的亲水性和抗原性均有很高峰值。SDS—PAGE电泳显示约56kDa的目的重组蛋白表达条带，Western—blot分析显示该重组蛋白可与恙虫病病人血清反应，阴性血清则未出现相应印迹，ELISA分析结果显示该蛋白最低浓度为80ng／μL时仍可检出阳性血清；5μg／mL蛋白可检测阳性血清滴度高达1：12800，证实其具有较强反应原性。本实验获得恙虫病东方体合肥株56kDa截短外膜蛋白基因工程抗原具有良好的抗原活性，有望进一步应用于恙虫病的诊断、疫苗研制及致病机制分析。; 耿美玲郑峰吕恒朱进胡丹郝丽娜张凤玉龚秀芳李丙军李先富潘秀珍王长军操敏; 关键词：恙虫病东方体抗原性基因表达

SsuDAT1I限制修饰系统在不同背景猪链球菌2型分离株中的分布被引量：3: 2013年; 目的探索SsuDAT1I限制修饰系统在不同背景的猪链球菌2型(SS2)分离株中的分布规律。方法选取29个不同背景SS2分离株,通过分析其全基因组序列或PCR检测purH和purD基因间是否含有SsuDAT1Ⅰ插入序列,并分别用MobⅠ和DpnⅠ酶切SS2基因组以鉴定其5′-GATC-3′序列位点是否存在甲基化。结果 29株SS2中有6株携带SsuDAT1Ⅰ限制修饰系统,且均为无(弱)毒株;其他23株不带SsuDAT1Ⅰ的SS2中有22株为强毒株,仅有1株为1980年代在荷兰分离的弱毒株T15。酶切显示,含有SsuDAT1Ⅰ的SS2菌株的基因组DNA可被DpnⅠ完全酶切,但不能被MobⅠ所酶切;其他缺失SsuDAT1Ⅰ的SS2菌株的酶切图谱则完全相反。证明SsuDAT1Ⅰ系统可对SS2基因组的5′-GATC-3′位点进行甲基化修饰。结论作为SS2基因组获得的外来遗传元件,对SsuDAT1Ⅰ的鉴定有助于分析SS2菌株的系统进化关系和毒力强弱。; 郑峰张凤玉郝丽娜龚秀芳朱进潘秀珍王长军; 关键词：猪链球菌2型毒力

用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法: 本发明涉及一种用于以RT-LAMP法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法。该引物包括HTNV引物组和SEOV引物组，两引物组分别包括外引物对，内引物对，以及环引物对，其序列如SEQ ID NO:3-14所示。该...; 王长军胡丹张锦海郝丽娜吕恒谭维国; 文献传递

汉坦病毒S基因的克隆及体外转录被引量：2: 2014年; 目的:通过基因克隆和体外转录,获得汉坦病毒汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的RNA全长cRNA,为汉坦病毒病原学检测提供阳性定量标准品。方法:设计汉滩型76118株和汉城型R22株S基因克隆引物,PCR获得相应片段,分别克隆至含双启动子的PCRⅡ载体中,测序鉴定无误后,重组质粒分别经内切酶SpeⅠ、SacⅠ线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物经DNase处理、纯化后测定浓度,经RT-PCR验证。结果:获得汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的cRNA片段,并可准确定量其拷贝数,76118株和R22株的质量浓度分别为80、17.58 ng/μL。结论:获得的cRNA样品可作为汉坦病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。; 郝丽娜胡丹吕恒张锦海张凤玉龚秀芳李丙军朱进潘秀珍姚苹苹张云王长军陈建华; 关键词：汉坦病毒克隆体外转录

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：8: 2014年; 目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x+40.988(HTN),y=-3.5307x+39.356(SEO),扩增效率分别为92.2%(HTN)和92.6%(SEO),相关系数R2分别为0.9968(HTN)和0.9997(SEO),呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。; 胡丹郝丽娜李丙军张锦海吕恒张凤玉龚秀芳耿美玲谭维国操敏郑峰朱进姚苹苹张云王长军; 关键词：汉坦病毒荧光定量PCR

荚膜唾液酸对猪链球菌激活巨噬细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路影响的研究被引量：4: 2013年; 【目的】探索猪链球菌2型感染后单核/巨噬细胞启动信号转导通路机制,探讨荚膜唾液酸对细菌激活巨噬细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的影响。【方法】以小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,采用RT-PCR、Western blotting、免疫荧光和ELISA法分别检测猪链球菌2型野毒株、唾液酸缺失突变株、唾液酸回复突变株感染后不同时间点巨噬细胞TLR2 mRNA转录水平、AKT磷酸化水平、NF-κB激活程度以及前炎症因子TNF-α分泌水平;再分别用TLR2阻断剂和PI-3K抑制剂预处理巨噬细胞,检测上述分子的表达水平。【结果】唾液酸缺失株可选择性的活化信号转导通路途径。RT-PCR结果表明,缺失株TLR2 mRNA表达水平自1 h开始升高,1.5 h达高峰后有所下降;Westernblotting显示,缺失株TLR2蛋白表达水平7 h达高峰,9 h下降;p-AKT水平1.5 5 h持续稳定在高峰水平,7 h后开始下降;免疫荧光可见15 min NF-κB激活-核转运程度较高;ELISA结果显示,10 h之后TNF-α的水平显著高于野生株和回复株。使用TLR2阻断剂和PI-3K抑制剂,三菌株通路活化程度均明显受抑制。【结论】荚膜唾液酸可抑制宿主免疫细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的激活,藉此参与细菌逃避宿主的免疫防御作用。; 朱静胡丹刘丽娜张锦海张凤玉郝丽娜耿美玲郑峰朱进潘秀珍王长军; 关键词：猪链球菌2型巨噬细胞信号通路

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体被引量：2: 2014年; 目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物，建立染料法（SYBRgreenI）实时荧光定量PCR，评估其灵敏性及特异性；并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r2=0．99），灵敏性评估显示20¨l体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测，最低检出浓度为2拷贝／¨l，比普通PCR检测方法提高1～2个数量级，并且具有较好的重复性；建立的SYBRI染料法具有良好的特异性，与立氏立克次体R株等其他5种立克次体，以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增；用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器，以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测，其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本，结果脾脏中东方体检出量最多，肝脏和肾脏次之，血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性，适合各种样本中东方体的快速检测，可用于实验室的快速诊断。; 耿美玲操敏张锦海胡丹郝丽娜张凤玉龚秀芳李丙军潘秀珍王长军; 关键词：恙虫病荧光定量PCR法

郝丽娜

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