方益锋
- 作品数：7 被引量：4H指数：1
- 供职机构：温州医学院附属第一医院更多>>
- 发文基金：卫生部科学研究基金浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 构建含有小鼠CD40-IgG2aFc—IRS—GFP融合基因腺病毒并体外检测被引量：2
- 2010年
- 目的构建载有小鼠CD40-IgG2aFc—IRS—GFP融合基因片段的腺病毒载体，并检测其转染293细胞后的融合蛋白表达及出毒情况。方法提取小鼠CD40、IgG2aFc基因片段构建PDC316-IgG2aFc—GFP质粒，测序成功后包装构建AdS—PDC316-CD40-IgG2aFc—GFP，转染293细胞。出毒后大量复制病毒并纯化，测定病毒滴度，体外感染细胞观察病毒复制及分泌目的蛋白情况并检测目的蛋白表达量。结果成功构建了质粒及病毒，体外感染显示该病毒能有效的感染细胞并表达蛋白（荧光显示），检测目的蛋白表达量随时间点及浓度增加而增加。当病毒浓度增加到一定程度时目的蛋白表达趋于无明显差异性。结论构建小鼠融合基因片段并成功转入细胞内，分泌表达目的蛋白是可行的，为进一步研究该病毒在大鼠体内感染及表达CD40Ig、大鼠肝移植模型免疫耐受及其机制的研究奠定了基础。
- 李传光方益锋谭映霞沈志坚张启瑜
- 关键词：CD40质粒构建
- 丹参素对大鼠减体积肝移植肝脏再生的影响被引量：1
- 2011年
- 目的:探讨丹参素对大鼠减体积肝移植后肝脏再生的影响。方法:采用改良"二袖套法"建立雄性SD大鼠60%减体积肝移植模型,受体随机分为生理盐水对照组(0.3mL/d)和丹参素治疗组[1mg/(kg·d)],术后第1、3、6天取肝脏及血清,检测肝再生率,血清ALT、ALB及肝组织增殖细胞核抗原(PCNA)标记指数,观察肝脏病理改变。结果:丹参素治疗组术后第6天肝再生率为(129.3±15.1)%、肝组织PCNA标记指数为(30.1±3.0)%,均高于生理盐水对照组(均P<0.05)。术后第3、6天,血清ALT分别为(263.2±35.9)、(142.0±26.0)U/L,较生理盐水对照组明显降低(均P<0.05),血清ALB分别为(18.9±1.9)、(21.4±2.3)g/L,较生理盐水对照组明显升高(均P<0.05)。结论:丹参素可以促进大鼠减体积肝移植后肝脏再生,并有助于肝功能的早期恢复。
- 吕和平薛涛孙运鹏方益锋张启瑜
- 关键词：肝移植丹参素增殖细胞核抗原
- 双重调控增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo的构建及鉴定
- 2011年
- 目的构建新型双重调控肿瘤特异性增殖型腺病毒载体治疗系统。方法通过基因重组技术构建受端粒酶逆转录酶启动子控制腺病毒E1A表达、缺氧反应元件启动子控制EIB表达并携带人内皮抑素基因的质粒pTPHre-hEndo。将质粒pTPHre-hEndo与含有腺病毒右臂的质粒pB-GHE3共转染至293细胞中同源重组得到带抗肿瘤基因的双重调控增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo。用TCID50方法测定病毒滴度。通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。利用ELISA法检测人内皮抑素抗癌基因的表达。结果成功构建了由双重调控的选择增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo，病毒滴度为3．25×10＾10pfu／ml。增殖实验结果证实AdTPHre-hEndo可以选择性地在端粒酶阳性的胰腺癌细胞中增殖。随着感染时间的延长，肿瘤细胞培养上清液中内皮抑素表达量不断增加，第7天达（310．25士1．41）ng／ml，明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体（112．53±4．41）ng／ml。结论AdTPHre-hEndo具有高效表达人内皮抑素和在胰腺癌细胞内增殖的能力，为胰腺癌的生物治疗提供了一种新型的基因-病毒治疗系统。
- 方益锋单云峰高申孟张启瑜
- 关键词：腺病毒端粒酶逆转录酶缺氧反应元件内皮抑素
- 增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo治疗胰腺癌的体外实验研究被引量：1
- 2010年
- 目的研究携带人内皮抑素基因的新型双重调控增殖型腺病毒AdTPHre-hEndo对胰腺癌细胞的体外治疗作用。方法采用四氮唑盐比色法(MTT)测定不同滴度的病毒AdTPHre-hEndo、Ad-hEndo、ONYX-015、Wad5对胰腺癌细胞和正常细胞的杀伤效应,通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力,利用Westernblotting和ELISA检测人内皮抑素治疗基因的表达。结果AdTPHre-hEndo、Ad-hEndo、ONYX-015、Wad5感染胰腺癌细胞杀伤的半数有效量(ED50)分别是MOI=0.624、MOI>100、MOI=0.781和MOI=0.284;感染正常细胞时Wad5的ED50为MOI=0.976,余三种病毒均为MOI>100。增殖实验结果证实AdTPHre-hEndo可以选择性地在胰腺癌细胞中增殖。随着AdTPHre-hEndo感染时间的延长,肿瘤细胞培养上清液中内皮抑素表达量不断增加,第7天达(310.25±1.41)ng/mL,明显高于感染正常细胞时的表达量(95.24±2.26)ng/mL(P<0.01)。结论AdTPHre-hEndo介导的治疗基因表达量在胰腺癌细胞中可得到放大,在胰腺癌细胞中具有特异性增殖及杀伤能力。
- 方益锋张启瑜吕和平单云峰周蒙滔
- 关键词：腺病毒内皮抑素胰腺肿瘤增殖
- 携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒AdTPHre—hE对胰腺癌的体内实验研究
- 2011年
- 目的 通过建立裸鼠胰腺癌肿瘤模型，在体内实验中进一步证实携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒AdTPHre-hE的抗肿瘤作用。方法 建立AsPC-1胰腺癌细胞BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型，在瘤体内注射AdTPHre-hE治疗，观察肿瘤生长。ELISA法检测裸鼠血清中人内皮抑素浓度，肿瘤组织行Hexon 单克隆抗体免疫组化染色及微血管免疫组化染色。结果 AdTPHre-hE抑制肿瘤生长的作用显著强于Ad-hE（P〈0.01）和对照组（P〈0.01）。随着治疗时间的延长，裸鼠血清中内皮抑素表达量不断增加，明显高于Ad-hE组（P〈0.01）和对照组（P〈0.01）。病毒Hexon免疫组化染色显示,AdTPHre-hE治疗组移植瘤内可见片状或弥漫性分布的阳性染色，AdTPHre-hE治疗组瘤组织中微血管密度为16.3±4.3明显少于Ad-hE组的33.8±6.2（P〈0.01）和对照组的36.8±4.6（P〈0.01）。结论 增殖型腺病毒AdTPHre-hE介导人内皮抑素的表达，具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用。
- 方益锋单云峰罗定存张启瑜
- 关键词：腺病毒内皮抑素胰腺癌
- 供肝转染含CD40Ig基因的腺病毒抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究
- 2010年
- 目的:通过腺病毒介导的CD40Ig基因治疗,阻断CD40/CD40L共刺激途径诱导免疫耐受,探讨CD40Ig对大鼠肝移植急性排斥反应的影响。方法:采用"二袖套管"法建立Lewis到BN大鼠肝移植急性排斥反应模型30只,A组10只为对照组;B组为病毒空壳组10只,术中肝脏冷保存前门静脉注射腺病毒空壳液1mL(7×1010vp/mL);C组10只为实验组,肝脏冷保存前门静脉注射含有CD40Ig基因病毒液1mL(7×1010vp/mL)。分别于术后4、7、10d每组各处死2只受体取血标本及肝组织,病理学检查肝组织及免疫组织化学检测CD40抗原的表达,ELISA法检测受体血清中的CD40Ig的表达,余大鼠观察生存情况。结果:C组移植大鼠平均存活时间延长至(53.25±13.37)d,较A组、B组明显延长(P<0.01)。C组肝脏急性免疫排斥明显减轻。A组、B组肝脏CD40抗原表达明显,C组未见CD40抗原明显表达。CD40Ig在受体内能成功表达,蛋白量于第7天最高,C组血中CD40Ig浓度明显高于A组、B组(P<0.01)。结论:重组CD40Ig基因的腺病毒能有效阻断T细胞共刺激途径,特异性抑制急性排斥反应,延长生存时间。
- 方益锋张启瑜李传光吕和平沈志坚
- 关键词：肝移植CD40重组腺病毒
- 增殖型腺病毒介导的人内皮抑素基因治疗胰腺癌
- 2010年
- 目的 观察携带人内皮抑素基因的双重调控增殖型腺病毒（AdTPHre-hEndo）对胰腺癌的治疗作用.方法 通过病毒重组技术将人内皮抑素基因克隆入双重调控增殖型腺病毒基因组中,获得腺病毒滴度为3.25×10^10pfu/ml;通过建立SW-1990胰腺癌细胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,分析基因转导后胰腺癌组织中内皮抑素的表达情况及对肿瘤血管的抑制作用.结果 构建了AdTPHre-hEndo;AdTPHre-hEndo组荷瘤裸鼠肿瘤体积显著低于携带人内皮抑素基因的重组腺病毒（Ad-hEndo）组（P＜0.01）和选择性增殖型腺病毒（ONYX-015）组（P＜0.05）;AdTPHre-hEndo组内皮抑素表达量明显高于Ad-hEndo组和对照组（P＜0.01）.AdTPHre-hEndo组肿瘤微血管密度（MVD）为6.8±2.5,Ad-hEndo组和对照组MVD分别为16.0±4.6（P＜0.01）、47.2±10.0（P＜0.01）.结论 所构建的AdTPHre-hEndo可有效表达具有生物学活性的内皮抑素,使肿瘤内微血管生成减少,肿瘤细胞增殖减慢,具备应用于胰腺癌临床治疗的潜力.
- 王学强方益锋吕和平单云峰张启瑜
- 关键词：胰腺肿瘤基因疗法内皮抑素类
