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人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：1: 2010年; 目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。; 薛鹏浩张淼涛张骞张钫袁武梅麻粉莲王翔郑丽舒; 关键词：人博卡病毒 TAQMAN探针实时定量PCR

Ⅲ型干扰素抗病毒应用研究进展被引量：1: 2009年; 干扰素（interferon，IFN）为庞大的细胞因子家族，具有抗病毒、抑制细胞生长和免疫调节等作用。根据氨基酸序列和受体的不同，干扰素可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三种类型。后者系Sheppard等和Ko-tenko等于2003年鉴定的一类干扰素，又称IFN-λ（IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，或IL-29、IL-28a和IL-28b）。它们利用IL-10R2和IFN-LR1组成的复合物作为受体，在抗病毒、抗增殖及体外抗肿瘤等方面发挥近似于而又不同于Ⅰ型干扰素的作用。; 张钫张骞; 关键词：抗病毒 IL-29 体外抗肿瘤免疫调节

人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白的原核表达及纯化被引量：6: 2009年; 目的表达并纯化人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白。方法用RT-PCR法从人甲型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)中扩增NS1基因,克隆入原核表达载体pTXB1,构建重组原核表达质粒pTXB1/NS1,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达形式和表达量。经几丁质柱亲和层析纯化表达蛋白,串联飞行时间质谱仪检测其相对分子质量。结果所构建的重组表达质粒pTXB1/NS1序列完整,插入的基因片段全长690bp。以1.0mmol/LIPTG37℃诱导4h,重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的50%以上。破菌上清及沉淀中均有目的蛋白表达。纯化的NS1蛋白纯度达95%以上,相对分子质量约为26000。结论已成功表达并纯化了人甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白,为其进一步的研究奠定了基础。; 麻粉莲李引乾郑丽舒张骞张万菊张钫刘斌侯云德; 关键词：H1N1亚型 NS1蛋白原核表达纯化

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达: 2009年; 目的:在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型(HPV6)L1的融合蛋白。方法:PCR方法扩增HPV6L1基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6 mL1,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果:酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol/L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论:获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。; 刘斌钱永华张骞张万菊张钫麻粉莲郑丽舒; 关键词：人乳头瘤病毒6型 L1基因蛋白表达

重组人干扰素λ1的表达、纯化及生物活性研究被引量：1: 2010年; 目的:利用大肠杆菌系统表达重组人Ⅲ型干扰素λ1(rhIFN-λ1),并进行纯化,以比较其与重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)生物学活性的差异。方法:密码子优化的rhIFN-λ1基因与pET-44a载体连接构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物经系列层析纯化;采用细胞病变抑制法比较纯化的rhIFN-λ1与rhIFN-α2b、市售rhIFN-λ1的抗病毒活性;采用MTS法比较这些干扰素的抗肿瘤细胞增殖活性。结果:基因优化后的rhIFN-λ1在大肠杆菌中得以高效表达,用所建立的纯化工艺可制备得到纯度达95.7%的rhIFN-λ1;rhIFN-λ1的抗病毒比活性为3.2×105 U/mg,比市售rhIFN-λ1的比活性(1.1×105 U/mg)略高,抗肿瘤细胞增殖活性为rhIFN-α2b的1.7倍。结论:获得的rhIFN-λ1具有剂量依赖的抗病毒活性和抗增殖活性,其抗病毒活性比市售rhIFN-λ1略高,抗细胞增殖活性高于rhIFN-α2b,提示rhIFN-λ1有较大的应用前景。; 张钫郑丽舒袁武梅王翔薛鹏浩麻粉莲张骞; 关键词：纯化抗病毒活性抗增殖活性

甲型H1N1流感病毒HA基因RT-LAMP检测方法的建立与初步应用被引量：9: 2011年; 目的:建立反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)检测甲型H1N1流感病毒HA基因的方法,并用于检测临床样本。方法:通过在线软件Primer Explorer V4设计H1N1 HA基因的RT-LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度。结果:与传统RT-PCR方法相比,RT-LAMP检测方法具备更高的灵敏度,达到10个拷贝,并且具有良好的特异性;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到2份阳性,与RT-PCR方法检测结果相同。结论:建立的H1N1 RT-LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,具备H1N1现场检测应用前景。; 王翔张骞张钫袁武梅麻粉莲薛鹏浩赵智慧郑文芝郑丽舒; 关键词：甲型H1N1流感病毒 RT-PCR RT-LAMP

人博卡病毒LAMP检测方法的建立及初步应用被引量：3: 2010年; 目的建立环介导等温扩增技术（LAMP）检测人博卡病毒（Human bocavirus,HBoV）基因的方法,并用于检测临床样本.方法通过在线软件设计工具Ptimer Explorer V4设计HBoV NP-1基因的LAMP引物,建立LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度.结果与传统PCR方法相比,LAMP法检测灵敏度更高,可达到10拷贝,特异性较强;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到5份阳性.结论建立HBoV LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,有望进行临床检测HBoV.; 王翔许信刚张骞张钫袁武梅麻粉莲薛鹏浩郑丽舒; 关键词：基因核酸扩增技术

人乳头瘤病毒16型L1蛋白VLP的原核表达及纯化: 2009年; 目的在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白病毒样颗粒(VLP),并进行纯化,为研制宫颈癌疫苗提供新的思路。方法以HPV16基因组DNA为模板,PCR扩增HPV16L1基因的编码区,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)编码区下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用GST纯化柱纯化重组融合蛋白,并用凝血酶切去GST标签,再经S100分子筛纯化,浓缩后,电镜观察纯化蛋白的VLP形态。结果重组表达质粒经双酶切和测序,证明构建正确。表达产物的相对分子质量约为80000,主要以可溶性形式存在。Western blot显示,目的蛋白可与小鼠抗HPV16L1抗体发生特异性反应。纯化蛋白的纯度约为95%,在电镜下可见直径约为50～60nm的VLP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性的HPV16L1蛋白VLP,并进行了纯化,为宫颈癌疫苗及血清学诊断试剂的研制奠定了基础。; 张万菊郑丽舒张骞谢志萍张钫麻粉莲刘斌; 关键词：人乳头瘤病毒16型主要结构蛋白病毒样颗粒原核表达

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张钫

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