杨幼聪
- 作品数：8 被引量：31H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项国家高技术研究发展计划陕西省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养与鉴定被引量：3
- 2011年
- 【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细胞经免疫组化法和碱性磷酸酶染色法鉴定呈阳性;透射电镜观察显示,细胞表面有微绒毛和桥粒连接。用流式细胞仪检测的结果显示,第4代新生山羊RTECs中G1期和S期细胞分别占细胞总数的25.01%和74.99%,G2/G1为1.97%,第10代细胞中G1期细胞和S期细胞均占50.00%,G2/G1为1.88%;第4代细胞的早期凋亡率在0.32%左右,而第10代可达3.7%,远高于第4代细胞。【结论】建立了增殖快、细胞活力高的山羊RTECs分离培养方法。
- 向华张彦明程媛媛康恺杨幼聪
- 关键词：原代培养酶消化纯化
- 流产型布鲁菌Omp10、Omp25蛋白的表达纯化与鉴定被引量：2
- 2012年
- 获得高纯度具有生物学活性的重组布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,并进行抗原性的分析。将用PCR扩增出的布鲁菌Omp10、Omp25基因片段分别克隆到原核表达载体pET-32α中,构建pET-32α-Omp10/Omp25原核表达质粒。将其转入大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中,用IPTG诱导表达,经HisTrap HP亲和层析柱分离纯化,分别用Western-blot和间接ELISA检测产物的抗原性。基因测序及酶切鉴定证明pET-32α-Omp10/Omp25原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明,Omp10、Omp25融合蛋白均以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达。经过包涵体的变性、复性及亲和层析纯化,成功获得了大小分别为34 000和44 000的融合蛋白,与预测的相对蛋白分子质量一致。Western和间接ELISA试验证明纯化的Omp10、Omp25融合蛋白能被免疫的牛布鲁菌阳性血清所识别。结果表明,成功获得了布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,且均具有一定的免疫原性,通过血清学反应证实,Omp10、Omp25蛋白为布鲁菌病临床诊断试剂盒的研制奠定了基础。
- 张三东王晶钰王利勤杨幼聪马超陈婷董睿李成山任娟娟刘万华
- 关键词：布鲁菌纯化抗原性
- 猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2011年
- 克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。
- 杨幼聪郭抗抗张彦明李宇立张倩程媛媛张三东彭维刚
- 关键词：原核表达
- 猪瘟病毒NS2 3′端基因的克隆与原核表达被引量：2
- 2011年
- 从真核表达载体pEGFP-NS2中克隆得到猪瘟病毒(CSFV)NS2 3′端的基因片段,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,克隆了大小为363 bp NS2 3′端的基因,重组载体pET-NS2-C363在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为33.84 ku,与预期结果一致。结果为进一步研究NS2蛋白与猪脐静脉血管内皮细胞中蛋白之间的相互作用提供材料及为制备单克隆抗体奠定基础。
- 杨幼聪张彦明康恺向华汤智慧张三东
- 关键词：猪瘟病毒NS2基因原核表达
- 分子伴侣Jiv90基因的克隆及其在猪脐静脉血管内皮细胞中的表达被引量：4
- 2010年
- 为研究分子伴侣Jiv90对猪瘟病毒复制的影响,克隆了分子伴侣Jiv90基因,构建了真核表达载体并在猪脐静脉血管内皮细胞中表达。根据牛的Jiv90基因序列和真核表达载体pEGFP-C1设计引物,经PCR扩增,成功克隆到猪Jiv90基因,回收后与pEGFP-C1载体连接,构建重组表达载体pEGFP-C1-Jiv90,提取质粒并采用脂质体法转染猪脐静脉血管内皮细胞。转染24 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,经G418抗性筛选得到阳性克隆。本研究成功构建了pEGFP-C1-Jiv90真核表达载体,得到稳定表达Jiv90的细胞株,为今后开展分子伴侣对猪瘟病毒复制影响的研究奠定了基础。
- 刘伟杨幼聪李宇立张彦明
- 关键词：猪瘟病毒真核表达
- 分子伴侣Jiv90的原核表达及其功能的初步研究
- 分子伴侣(molecular chaperones)是一组从细菌到人广泛存在的蛋白质,非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合,并帮助它们折叠和转运,通常不参与靶蛋白的生理功能。Lackner等人发现,宿主细胞的分子伴...
- 杨幼聪
- 关键词：分子伴侣原核表达
- 文献传递
- 猪Jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验被引量：2
- 2011年
- 【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。
- 李宇立张彦明程敏杨幼聪
- 关键词：猪血管内皮细胞打靶载体细胞转染猪瘟病毒
- 猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：19
- 2011年
- 【目的】建立一种能够实际应用于猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量检测的荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中登录号为AF091507的猪瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株的全长基因组序列,在其5′非编码区设计2对特异性引物（标准品引物、定量引物）和1条探针（qPCR-P）,通过标准品引物进行RT-PCR扩增及T7 RNA聚合酶体外转录构建标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法,并采用该法对成品猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行检测。【结果】成功构建了体外转录的标准品RNA,建立了检测猪瘟兔化弱毒的荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,比RT-nPCR方法的灵敏度高出1个数量级;该法对标准品RNA检测的线性范围为1.0×108~1.0×102拷贝/μL。对1.0×108,1.0×106,1.0×103拷贝/μL 3种稀释度的标准品RNA进行重复性试验,批内变异系数分别为0.54%,0.52%和0.39%;批间变异系数分别为1.47%,1.85%和1.01%,具有良好的可重复性。应用该方法对不同厂家猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行测定,可知同一厂家脾淋苗中的病毒含量比细胞苗高出1~2个数量级,而不同厂家同一类型疫苗中病毒含量也有差异,其中脾淋苗差异不大,而细胞苗间的差异较大,最高可达27.2倍。【结论】建立的猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR方法,具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为实际工作中对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量监控提供了重要的技术支撑。
- 邓力张彦明李维维杨幼聪谭晓妮
- 关键词：猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR体外转录
