张三东
- 作品数：15 被引量：74H指数：4
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项国家科技支撑计划公益性行业(农业)科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程医药卫生更多>>
- 流产型布鲁菌Omp10、Omp25蛋白的表达纯化与鉴定被引量：2
- 2012年
- 获得高纯度具有生物学活性的重组布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,并进行抗原性的分析。将用PCR扩增出的布鲁菌Omp10、Omp25基因片段分别克隆到原核表达载体pET-32α中,构建pET-32α-Omp10/Omp25原核表达质粒。将其转入大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中,用IPTG诱导表达,经HisTrap HP亲和层析柱分离纯化,分别用Western-blot和间接ELISA检测产物的抗原性。基因测序及酶切鉴定证明pET-32α-Omp10/Omp25原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明,Omp10、Omp25融合蛋白均以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达。经过包涵体的变性、复性及亲和层析纯化,成功获得了大小分别为34 000和44 000的融合蛋白,与预测的相对蛋白分子质量一致。Western和间接ELISA试验证明纯化的Omp10、Omp25融合蛋白能被免疫的牛布鲁菌阳性血清所识别。结果表明,成功获得了布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,且均具有一定的免疫原性,通过血清学反应证实,Omp10、Omp25蛋白为布鲁菌病临床诊断试剂盒的研制奠定了基础。
- 张三东王晶钰王利勤杨幼聪马超陈婷董睿李成山任娟娟刘万华
- 关键词：布鲁菌纯化抗原性
- 牛传染性鼻气管炎病毒XA株的分离与鉴定被引量：3
- 2010年
- 【目的】利用MDBK细胞进行牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)XA株的分离与鉴定。【方法】用MD-BK细胞从陕西发病奶牛鼻拭子中分离IBRV;使用IBR标准阳性血清对该病毒分离物进行中和试验;根据GenBank公布的IBRV基因组序列,利用gB保守序列设计1对引物,对分离病毒进行PCR扩增并测序。【结果】分离病毒在MDBK细胞上产生了明显的特征性细胞病变(CPE):细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞,偶见含有几个细胞核的巨大细胞;用标准抗IBRV特异性抗血清能完全中和分离株;用IBRV gB特异性引物进行PCR,可扩增出1 182 bp的特异性条带,目的序列与已发表的IBRV基因组序列一致。【结论】该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒,将其命名为IBRV XA株。
- 李河林王晶钰刘红彦张三东
- 关键词：IBRVPCR
- 猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2011年
- 克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。
- 杨幼聪郭抗抗张彦明李宇立张倩程媛媛张三东彭维刚
- 关键词：原核表达
- 布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用被引量：11
- 2010年
- 根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 bp片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法从布鲁菌标准菌株中扩增出了特异性的目的片段,而对大肠埃希菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀释的模板进行检测,多重PCR的敏感度为最低可检出1.1×10-3ng的DNA,在感染布鲁菌病奶牛乳汁模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/mL。不同人员用该方法重复检测,结果均一致,表明重复性好。应用该方法对88份临床疑似布鲁菌感染的奶牛乳样进行了检测,结果检出17份阳性,阳性检出率约为19.3%。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁菌病的临床检测及流行病学监测等。
- 王晶钰张三东刘红彦李河林程媛媛李宇立战美娜
- 关键词：布鲁菌外膜蛋白基因多重PCR
- 牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法的建立被引量：5
- 2011年
- 【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。
- 程媛媛张彦明向华康恺李艳明徐磊董玲娟张三东
- 关键词：布鲁氏菌单增李斯特菌双重PCR牛奶
- 猪瘟病毒NS2 3′端基因的克隆与原核表达被引量：2
- 2011年
- 从真核表达载体pEGFP-NS2中克隆得到猪瘟病毒(CSFV)NS2 3′端的基因片段,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,克隆了大小为363 bp NS2 3′端的基因,重组载体pET-NS2-C363在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为33.84 ku,与预期结果一致。结果为进一步研究NS2蛋白与猪脐静脉血管内皮细胞中蛋白之间的相互作用提供材料及为制备单克隆抗体奠定基础。
- 杨幼聪张彦明康恺向华汤智慧张三东
- 关键词：猪瘟病毒NS2基因原核表达
- 牛β-防御素BNBD11基因在大肠杆菌中的表达
- 2011年
- 探索牛β-防御素BNBD11原核表达及纯化的技术路线。根据已报道的BNBD11的氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计合成BNBD11基因。构建重组表达载体pET32a-BNBD11,转入E.coli BL21,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。经SDS-PAGE检测融合蛋白结果显示,大部分表达产物以可溶形式存在,用Ni Sepharose柱层析纯化融合蛋白。融合蛋白经甲酸切割后,再次用Ni Sepharose柱层析去除带有His-Tag的杂蛋白,最终得到纯化的重组BNBD11。实验实现了BNBD11在大肠杆菌中的融合表达,并纯化了获得的重组BNBD11。
- 赵建乐陈琛闫茂仓张小莺李引乾张三东
- 关键词：Β-防御素大肠杆菌
- 布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用
- 根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 ...
- 王晶钰张三东刘红彦李河林程媛媛李宇立战美娜
- 关键词：布鲁菌外膜蛋白基因多重PCR
- 文献传递
- 鸡源致病性大肠埃希菌中氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测被引量：7
- 2012年
- 为了解鸡源致病性大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性变化和钝化酶耐药基因的携带情况及耐药基因与耐药性的相关性,从陕西、河南、河北、山西、宁夏和甘肃6省(区)的部分规模化养鸡场的病、死鸡中分离鉴定320株致病性大肠埃希菌。采用K-B药敏纸片法检测分离菌对6种氨基糖苷类药物的敏感性,PCR方法检测6种氨基糖苷类钝化酶耐药基因,用DNA Star软件对获得的耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对。结果显示,鸡源致病性大肠埃希菌分离株对庆大霉素、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、新霉素和阿米卡星的耐药率分别为53.4%、49.3%、37.5%、34.7%、22.8%和5.3%,对妥布霉素和卡那霉素耐药率呈上升趋势,而对庆大霉素的耐药率虽呈下降趋势,但仍维持在40%以上。3重以上耐药菌株占80%(256/320)。氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅰ和aac(6′)-Ⅰ的检出率分别为50.9%、25.9%和3.1%,未检测到aac(3)-Ⅳ、ant(3′′)-Ⅰ和aph(3′)-Ⅱ基因。研究表明,分离的鸡源致病性大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性普遍存在,以多重耐药为主,且对妥布霉素和卡那霉素的耐药性不断上升。耐药基因aac(3)-Ⅱ和aph(3′)-Ⅰ的检出率与其耐药性呈正相关。
- 王利勤王晶钰董睿张三东江跃德陈占莉李志良
- 关键词：大肠埃希菌耐药性
- 柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的克隆表达及免疫保护性研究
- 2011年
- 【目的】对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌株RB1-a基因进行克隆与表达,检测表达产物的免疫保护性,为鸡球虫基因工程疫苗的研制奠定基础。【方法】以纯化的E.tenella杨凌株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出其RB1-a基因,测序后进行序列分析。然后将RB1-a基因N端不含信号肽序列克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建pET-32a-RB1-a重组质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,对其免疫效果进行评价。【结果】柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的开放阅读框(ORF)包含618个碱基,编码205个氨基酸,与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫PAPa46株ORF序列相似性为99.84%,两者推导的氨基酸序列相同。SDS-PAGE分析表明,重组质粒表达分子质量为42ku的融合蛋白。免疫效果测定结果显示,RB1-a免疫组和RB1-a+佐剂免疫组的相对增重率分别为64.2%和69.4%,卵囊减少率分别达37.22%和30.56%,抗球虫指数分别为146.2和150.4。【结论】RB1-a基因具有很强的保守性,种间差异不大;RB1-a重组蛋白具有一定的免疫保护效果。
- 彭维刚黄妮林青胡冰张三东于三科
- 关键词：克隆免疫保护
