孙春清
- 作品数：5 被引量：26H指数：2
- 供职机构：中国农业科学院上海兽医研究所更多>>
- 发文基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目上海市技术标准专项上海市重大科技攻关项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株细胞传代研究被引量：1
- 2012年
- 为研究猪源牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)生物学特性,将本实验室分离得到的SD0803毒株在马-达氏牛肾细胞(mardin-darby bovine kidney,MDBK)上连续传40代,提取第40代病毒基因组RNA,设计扩增及测序引物,用RT-PCR方法分5段扩增第40代病毒基因片段,并进行全长测序,利用DNASTAR软件进行序列拼接及分析,与亲代病毒SD0803序列比对分析;用Real-time PCR方法测定第1、10、20、30和40代细胞上清中的病毒复制效率,并绘制多步生长曲线。测序结果表明,第40代病毒与亲代病毒核苷酸序列的同源性为99.8%,氨基酸序列的同源性为99.6%,其中有23处发生核苷酸突变,14处为有义突变,氨基酸变化主要集中在E2和NS5B区域。多步生长曲线显示,传代病毒和亲本病毒均能在MDBK细胞上获得较高的复制效率,并有着相似的生长特性,复制效率基本一致。本次研究为研制猪源BVDV疫苗做好了物质储备,为下一步研究其致病性和抗原性奠定基础。
- 孙春清邓宇张宏彪龙进学韦祖樟童光志袁世山
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒REAL-TIMEPCR
- 猪源乙型脑炎病毒HEN0701株全基因组的分子特征被引量：5
- 2011年
- 将乙型脑炎病毒HEN0701株基因组RNA分4段进行RT-PCR扩增,并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO载体中,测定全长cDNA序列。以MapDraw软件分析了乙型脑炎病毒HEN0701株的基因组结构,并将病毒基因组分成2个非编码区和10个基因,比较了HEN0701株和11株乙型脑炎病毒在全基因组和各基因的核苷酸及推导氨基酸的同源性。以MEGA5软件绘制HEN0701株和11株病毒C、E、NS3、NS5基因的进化树。结果显示,HEN0701株全基因组为10 965 nt,包含一长10 299 nt的开放阅读框。在核苷酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株的全基因组和各基因的同源性均高,而与GⅢ分离株则较低;而在氨基酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株在多聚蛋白和各病毒蛋白的同源性和HEN0701株与GⅢ分离株的相近。进化分析显示,不同基因进化树的拓扑结构相近,12株病毒的C、E、NS3、NS5基因进化方向相同,GⅠ分离株和GⅢ分离株间C基因进化距离最近。
- 郑浩孙春清袁世山
- 关键词：乙型脑炎病毒全基因组
- 1株猪源牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定被引量：20
- 2012年
- 从BVDV阳性仔猪病料中分离病毒,为开展猪源BVDV病原学研究奠定基础。将处理后BVDV阳性仔猪组织样品接种MDBK细胞,分离到1株猪源BVDV,命名为SD0803株。通过细胞培养、直接免疫荧光、5′-UTR与Npro PCR扩增、电镜观察、TCID50测定及对其分子进化特征加以分析。结果表明,该毒株在MDBK细胞上盲传至13代未出现细胞病变。在直接免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。PCR扩增分别获得5′-UTR与Npro预期大小DNA片段。电镜观察,病毒粒子略呈圆形,有囊膜,直径约50nm。病毒滴度为10-6.5 TCID50.0.2 mL-1。SD0803 5′-UTR、Npro序列进化分析显示,该分离株属于BVDV-1,与已知BVDV-1各亚型之间同源性较低,单独成一分支。结果表明,成功分离鉴定1株猪源BVDV SD0803,该毒株为非致病变型BVDV-1,极有可能为BVDV-1新的亚型。
- 邓宇孙春清张宏彪蔺涛张荣龙进学黄律曹三杰袁世山文心田郑浩
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒进化分析
- 猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备被引量：1
- 2012年
- 表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。
- 邓宇蔺涛孙春清张宏彪张荣龙进学黄律文心田曹三杰童光志袁世山郑浩
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体制备
- 猪源牛病毒性腹泻病毒SDO803株细胞传代研究
- 牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV）主要感染反刍动物，在90年代中期，我国开始发现猪群中存在牛病毒性腹泻病毒。目前对该病毒的深入研究比较少，致病机理还不是很清楚，其对猪群...
- 孙春清
- 关键词：猪源牛病毒性腹泻病毒流行病学调查荧光定量PCR
