乐耕耘
- 作品数：6 被引量：24H指数：4
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所更多>>
- 发文基金：云南省应用基础研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 重组杆状病毒表达HEV ORF2抗原片段被引量：7
- 2001年
- 目的 用重组杆状病毒表达戊型肝炎病毒 (hepatitisEvirus,HEV)ORF2基因片段 ,并对其免疫学特性进行研究。方法 与中间转染载体pVL1 3 93相连构建重组质粒 ,在Lipofectin介导下将其与杆状病毒线性DNA(BaculoGoldTM)共转染Sf9昆虫细胞得到重组病毒 ,用免疫荧光 ,Westernblot等方法对表达产物进行免疫学特性初步研究 ,并进行动物免疫试验。结果 含ORF2结构基因片段的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中获得了高效表达 ,经免疫荧光 ,Westernblot,动物免疫试验证实该重组蛋白为HEV特异性蛋白 ,可刺激机体产生相应抗体。结论 重组杆状病毒能有效表达HEV抗原基因 ,所表达的ORF2重组蛋白具有HEV抗体识别的抗原表位 ,具有较好的抗原性和免疫原性。
- 杜瑞娟马雁冰唐浩庄俊英乐耕耘刘勇戴长柏孙茂盛
- 关键词：杆状病毒HEVORF2基因
- 戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖被引量：10
- 2001年
- 目的探索戊型肝炎病毒(HEV)敏感细胞及体外培养条件,为HEV体外研究提供基础。方法用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行毒种的扩增与活化,超速离心处理猴阳性粪便标本获取培养用毒种,将其接种于各种人源性细胞(包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela)和非人灵长类细胞(非洲绿猴肾细胞Vero),通过细胞病变观察、RT-PCR检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感。结果KMB17、A549、BEL7402细胞中第一代传代7～9d出现细胞病变,11～13d脱落,传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在,而Hela、Vero细胞未见细胞病变,分别于2～4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段。在KMB17细胞培养体系中经免疫荧光实验表明实验组有明显荧光着色,病毒捕获RT-PCR扩增到特异片段。结论在采用的培养条件下,KMB17、A549、BEL7402细胞对HEV敏感,而Hela、Vero细胞不敏感,本研究建立了一定代次内HEV组织培养体系。
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- 关键词：戊型肝炎病毒RT-PCRKMB17二倍体细胞戊型肝炎
- 戊型肝炎病毒抗原基因片段及其组合表达质粒的构建被引量：1
- 2000年
- 目的选择及组合戊肝病毒 (HEV)抗原基因片段 ,进行表达与免疫学特性研究。方法根据已公布的 HEV序列 ,选择三段优势抗原表位 ,经 RT- PCR扩增基因片段 ,产物以单独或经甘氨酸连接肽串联组合的方式克隆到载体 pThioHis C中 ,经 DNA序列分析后 ,将构建的重组质粒转入大肠杆菌中进行表达 ,并以 Western印迹分析初步考察其免疫学特性。结果构建的六个重组质粒在大肠杆菌中获得了不同程度的表达 ,表达的目的蛋白具有与戊型肝炎患者阳性血清特异性结合的能力。结论 HEV抗原片段及其组合在大肠杆菌中得到了高效表达 ,并为优良诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供了基础。
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- 关键词：基因克隆大肠杆菌基因表达戊型肝炎病毒
- 戊型肝炎病毒（HEV）组织培养的研究
- ＜正＞戊型肝炎病例分布于全世界,主要流行于发展中国家.我国戊肝感染率平均为17.2%,全国各地均有散发流行,新疆、吉林、辽宁、山东出现过暴发流行,累计20万人患病.患者发病后,肝脏损害严重,在老年人、孕妇中尤为突出,可出...
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- 文献传递
- 戊型肝炎病毒ORF3基因在杆状病毒系统中的表达与免疫学性质被引量：7
- 2001年
- 目的 利用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒(HEV)ORF3，为进一步研究免疫学性质与功能提供基础。方法 通过RT-PCR方法获得HEV ORF3基因的目的基因片段，插入中间转染载体质粒pVL1393，构建重组质粒，再与杆状病毒线性DNA(BaculoGoldTM)共转染Sf9昆虫细胞，通过同源重组得到重组杆状病毒。以此重组杆状病毒感染昆虫细胞后，对表达的重组蛋白进行免疫学检测并免疫小鼠。结果 表达的重组蛋白约占昆虫细胞总蛋白的2%，可被戊型肝炎患者与实验猴阳性抗血清有效识别，并能诱导小鼠产生对HEV特异性免疫应答。结论 重组杆状病毒可高效表达HEV ORF3基因片段，表达产物具有HEV特异的免疫原性。
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- 关键词：戊型肝炎病毒杆状病毒免疫应答
- 戊型肝炎病毒ORF2片段与ORF3嵌合重组抗原的纯化与免疫学性质被引量：6
- 2001年
- 目的 考察具有多个优势抗原表位区段嵌合表达的戊型肝炎病毒（HEV）重组抗原的免疫学性质。方法 将构建的含有3个不同HEV抗原表位基因(ORF2．1: 6287 ～ 6403nt, ORF2．2: 6743 ～ 7126nt, ORF3)的表达质粒pThioHisORF(2．1＋2．2＋3 )在大肠杆菌中进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，其表达产物P_(2．1＋2．2＋3 )在8 mol/L尿素下经阳离子柱SP Sepharose FF层析纯化，透析复性。以P_(2．1＋2．2＋3 )免疫家兔和小鼠, 通过ELISA检测实验动物血清及戊型肝炎患者阳性血清IgG抗体，以Western蛋白印迹检测动物免疫血清对杆状病毒系统表达的抗原片段及嵌合抗原P_(2．1＋2．2＋3 )对患者阳性血清的免疫反应性。结果 纯化的抗原纯度达90%以上；免疫动物血清中检测到特异性抗体的滴度分别为1∶25 600（家兔）和1∶12 800（小鼠）以上，抗血清能够特异识别杆状病毒系统表达的HEV抗原片段，P_(2．1＋2．2＋3 )能与患者阳性血清特异反应。结论 嵌合表达的HEV重组抗原P_(2．1＋2．2＋3 )具有良好的免疫原性和免疫反应性，为进一步研究开发HEV诊断试剂盒及基因工程疫苗提供了基础。
- 唐浩马雁冰杜瑞娟乐耕耘李春宏庄俊英刘勇孙茂盛戴长柏
- 关键词：戊型肝炎病毒纯化免疫
