汪建华
- 作品数：67 被引量：130H指数：7
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学轻工技术与工程更多>>
- 酮古龙酸菌细胞色素c的表达、成熟及活性分析被引量：1
- 2011年
- 目的:从酮古龙酸菌Y25中扩增细胞色素c基因,在大肠杆菌中表达、成熟并进行生物活性分析。方法:从酮古龙酸菌Y25基因组中PCR扩增细胞色素c基因,构建pET22b表达载体;从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增细胞色素c成熟基因簇ccmABCDEFGH,连接到带有山梨糖脱氢酶组成型启动子的pBBR1MCS2-P200载体中;将构建的2个质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行血红素染色检测;通过氧化还原光谱法对Ni柱亲和纯化的重组蛋白进行活性分析。结果:扩增得到1404 bp的细胞色素c基因及6481 bp的ccmABCDEFGH基因簇;重组菌株经IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析,可见相对分子质量为50×103的表达条带;血红素染色显示重组蛋白结合有血红素;经氧化还原光谱扫描,显示亲和层析纯化得到的目的蛋白有细胞色素c特征吸收峰。结论:从酮古龙酸菌Y25中扩增得到了细胞色素c基因,在大肠杆菌中进行了表达和成熟,表达蛋白具有细胞色素c生物活性。
- 程红熊向华赵岩汪建华张怡轩张惟材
- 关键词：细胞色素C电子传递
- 甲基营养菌MP688基因组完成图构建
- 2011年
- 目的:在Solexa测序建立的甲基营养菌MP688基因组精细图的基础上,构建MP688基因组完成图。方法:根据MP688基因组序列设计引物,进行常规PCR扩增,填补Scaffold内部缺口;利用BLASTN、BLAT软件分析预测6个Scaffold定位关系;通过组合PCR、长距离PCR等填充Scaffold间的物理缺口。结果:常规PCR填充Scaffold内部4个缺口;BLASTN、BLAT软件分析预测了Scaffold定位关系;组合PCR填充Scaffold间的2个物理缺口,长距离PCR填充其余4个物理缺口。结论:得到了MP688的基因组完成图,为MP688的吡咯喹啉醌生物合成途径的阐明和进一步的代谢工程育种奠定了基础。
- 智静娟熊向华何建勇汪建华何涛张惟材
- 关键词：甲基营养菌
- 甲基营养菌MP688胞外多糖合成的影响因素研究
- 2013年
- 目的：考察培养基组分和发酵条件对甲基营养菌MP688合成胞外多糖的影响，确定最主要的影响因素。方法：将甲基营养菌MP688接种到基础培养基中，通过改变基础培养基的氮源、培养温度、初始pH值和培养时摇床转速等条件，检测在每种条件下培养5 d后发酵液中的多糖含量，确定每种因素的最适范围；进而选取8个因素，通过Plackett-Burman实验设计12组实验，通过检测每种组合条件下的多糖产量和结果统计分析，确定影响多糖合成的最主要因素。结果：甲基营养菌合成胞外多糖的最适氮源为硝酸钠，最适温度为30-37°C，最适pH值为6.5-7.0，最适摇床转速为200-250 r/min；甲醇、硝酸钠、初始pH值和接种量是MP688合成多糖的主要影响因子。结论：运用Plack-ett-Burman实验设计筛选到甲基营养菌MP688胞外多糖合成的主要影响因子，MP688是具有多糖生产潜力的菌株。
- 葛欣韩月梅熊向华汪建华刘党生张惟材
- 关键词：甲基营养菌胞外多糖
- 氧化葡糖杆菌sndh-sdh基因簇的克隆表达被引量：1
- 2012年
- 目的:从氧化葡糖杆菌H763中克隆sndh-sdh基因簇,在大肠杆菌和氧化葡糖杆菌621H中分别表达山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶(SNDH-SDH),并检测其活性。方法与结果:以氧化葡糖杆菌H763基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及终止序列在内的sndh-sdh基因簇,回收3533 bp的扩增产物,连入pMD18T载体,转化至大肠杆菌DH5α中表达;以山梨糖或木糖为底物,DCIP法检测菌体裂解液,DCIP检测液颜色由蓝绿色变为黄色,表明大肠杆菌表达产物具有脱氢酶活性。构建pBBR1MCS2-sndh-sdh载体,通过接合转移导入氧化葡糖杆菌621H,重组葡糖杆菌在以山梨醇或山梨糖为底物的培养基中培养,采用薄层层析检测法检测其培养上清中的代谢产物,层析板上显示了2-酮基-L-古龙酸斑点。结论:重组大肠杆菌DH5α和氧化葡糖杆菌621H中均表达了有脱氢酶活性的SNDH-SDH。
- 侯伟熊向华陈微微汪建华舒伟袁志刚张惟材
- 关键词：山梨糖脱氢酶2-酮基-L-古龙酸
- A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测被引量：4
- 2016年
- 目的从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(Bo NT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定。方法根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成Bo NT/A LC序列,克隆至p TIG质粒,转化BL21(DE3)plys S感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经"吸附-洗脱-扩增"程序淘选富集抗体并进行特异性筛选。PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性。结果可溶性表达的Bo NT/A LC占全菌蛋白的36.8%,纯化后蛋白纯度达99%。从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合Bo NT/A LC蛋白。结论该研究得到了两株特异性的Bo NT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗。
- 赵鹏胡颖安佳佳韦娜熊向华汪建华张惟材徐威
- 关键词：噬菌体抗体库
- 融合蛋白技术的应用被引量：5
- 2004年
- 汪建华
- 关键词：基因表达基因工程
- 一种促进酮古龙酸菌生长和产酸的方法
- 本发明提供了一种促进酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)生长和产酸的方法。通过在酮古龙酸菌培养基中添加营养因子硫辛酸，能够提高酮古龙酸菌的生长速度和产酸能力，从而达到用单菌发酵的方法实现糖酸转化...
- 熊向华张惟材汪建华韩双侯伟
- 文献传递
- 成纤维细胞生长因子受体3胞外配体结合区的重组表达及其与A型肉毒毒素重链C端的相互作用
- 2015年
- 目的:实现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)胞外配体结合区FGFR3D23的表达与纯化,并鉴定其与A型肉毒毒素重链C端(Bo NT/AHc)的相互作用。方法:全基因合成的FGFR3D23基因片段经酶切连入p TIG(+)质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,获得的包含体经Ni2+柱纯化,透析复性后通过pull-down及ELISA检测纯化蛋白与Bo NT/AHc的相互作用。结果与结论:SDS-PAGE分析结果显示得到相对分子质量约27×103的蛋白特异表达条带,表达量为1.39 mg/L,包含体占73.4%;纯化和复性得到的目的蛋白纯度约96%,复性率约3%;pull-down及ELI-SA实验结果证明FGFR3D23可以与Bo NT/AHc特异性地相互作用。
- 郭彬熊向华汪建华游松张惟材
- 关键词：成纤维细胞生长因子受体3相互作用
- 酮古龙酸菌细胞色素c基因的克隆及表达
- 2010年
- 目的:从酮古龙酸菌SCB329中分离细胞色素c(Cytc)相关基因,在大肠杆菌中进行表达并验证。方法:根据酮古龙酸菌SCB329基因组序列设计引物,通过PCR从SCB329基因组中扩增cytc基因,酶切后连接pET22b表达载体,转化至大肠杆菌DH5α后提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3),并对表达条件进行考察;用Chelating Sepharose珠粒对可溶性的Cytc-His融合蛋白进行纯化;经光谱扫描和血红素染色等方法对表达蛋白定性分析。结果:PCR扩增的cytc基因长513 bp;重组菌在IPTG浓度为0.025 mmol/L的条件下,于28℃诱导10 h后,SDS-PAGE分析可见表达条带,相对分子质量约为18×103;Ni柱亲和层析纯化得到目的蛋白,纯化蛋白经光谱扫描呈现Cytc特征峰,血红素染色呈现阳性结果。结论:从酮古龙酸菌SCB329中分离得到一种cytc基因,并表达纯化了融合蛋白Cytc-His,纯化蛋白呈现Cytc特性,为研究酮古龙酸菌中产酸关键酶的电子传递机制奠定了基础。
- 贾宁熊向华赵岩汪建华何建勇张惟材
- 关键词：细胞色素C电子传递
- 信号肽对酮古龙酸菌山梨糖脱氢酶表达的影响被引量：1
- 2010年
- 目的:在大肠杆菌中表达山梨糖脱氢酶(SDH),通过比较携带及不携带自身信号肽时SDH功能的差异,研究信号肽的作用。方法:通过PCR从酮古龙酸菌SCB329基因组中扩增带有自身信号序列和不带自身信号序列的sdh基因序列,连接至载体pET22b,在大肠杆菌中表达;利用载体的周质信号肽将缺少自身信号肽的SDH在大肠杆菌周质中表达,考察并比较这些表达情况的异同。结果:各种方式下表达的SDH都有活性,并能在体外体系中实现产酸;同时,在酶的前端带上自身信号肽或载体信号肽的情况下,在添加人工电子受体后能够实现活菌体内产酸。结论:山梨糖脱氢酶前端有一段与蛋白的周质定位相关的信号肽,去除该信号肽后酶的表达量有所增强,但在一定情况下影响了SDH的体内产酸作用。
- 韦泓丽熊向华汪建华游松张惟材
- 关键词：山梨糖脱氢酶大肠杆菌信号肽
