李平
- 作品数：17 被引量：22H指数：3
- 供职机构：复旦大学上海医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市青年科技启明星计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定被引量：4
- 2004年
- 为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K ,获得融合基因表达质粒pZWY ATF PAI2CD .该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,然后用甲醇诱导表达 .工程菌用摇瓶发酵 ,表达产物ATF PAI2CD占培养液中总蛋白 5 0 %以上 .经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达 95 % .Western印迹检测具有PAI 2与uPA的免疫原性 ,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 .经流式细胞仪 (FCM )检测 ,能与肿瘤细胞特异性结合 .结果表明 ,ATF PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达 ,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能 .提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景 .
- 王霞侯敏孙兴会张宇清李平谭理朱运松
- 关键词：融合蛋白基因毕赤酵母克隆尿激酶型纤溶酶原激活物
- 肺癌细胞高、低转移株中uPA基因启动子的序列和活性被引量：1
- 2004年
- 目的 分析人肺巨细胞癌高、低转移株中uPA基因启动子序列差异和这种差异对启动子活性的影响。方法 用PCR分段扩增人肺巨细胞癌高 (95D)和低 (95C)转移细胞株中uPA基因启动子序列 ,将uPA启动子亚克隆到荧光素酶为报告基因的 pGL3 Basic载体上 ,转染 95D或 95C细胞 ,分析启动子活性。 结果 95D与 95C细胞uPA基因启动子序列中有 3个位点碱基的差别 ,95D分别是 - 1933bp为“T” ,- 4 2 4bp为“C” ,- 96bp为“G” ,而 95C分别为“C”、“T”、“T”。这些不同对启动子活性的影响未见差别。在 - 2 14 3/ - 182 4之间存在uPA基因启动子的增强子序列 ,在 - 182 4 / - 4 0 8之间存在uPA启动子的负性调控序列。结论 uPA在 95D与 95C细胞中表达的差别不是直接由于启动子序列差别引起的 。
- 王丽石李平谭理朱运松
- 关键词：肺癌转移株UPA基因启动子活性癌细胞
- HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验
- 2004年
- 目的 表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力。方法 用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20—lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体。将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)_(600nm)达到0.6时,加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力。结果 IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20％以上。表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85％以上目的蛋白。凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变。结论 融合蛋白HA20—lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率。
- 孙兴会张宇清王霞侯敏谭理李平朱运松
- 关键词：大肠埃希菌融合基因基因表达
- 胚胎干细胞来源的内皮细胞构建内皮化血管支架被引量：2
- 2007年
- 目的探索胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞,并用于构建内皮化血管支架,为临床心血管疾病治疗提供实验基础。方法采用改良后单层分化体系,血管内皮生长因子(VEGF)作为独立诱导因子定向诱导胚胎干细胞分化为血管内皮细胞,用RT-PCR法检测分化时程各时间点内皮特异性标志的表达,用免疫荧光法检测分化体系中的内皮细胞蛋白标志。将分化成熟的内皮细胞种植于支架表面,构建内皮化血管支架。结果胚胎干细胞全能性分子标志Oct3／4,早期内皮标志Flk-1,Tie-2,PECAM-1,以及成熟内皮标志VE-cadherin在胚胎干细胞分化体系中呈现一定的转录时序性;免疫荧光结果显示分化细胞Flk-1,VE-cadheiin阳性,血管支架被表达VE-cadherin的内皮细胞覆盖。结论我们改良了胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的方法,并用于探索内皮化血管支架的构建。
- 钟贞杨健李平谭理应其龙宋后燕
- 关键词：胚胎干细胞分化
- p21抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究被引量：3
- 2002年
- 目的 探讨p2 1基因转染诱导体外培养的人血管平滑肌细胞 (HVSMC)凋亡进而抑制其增殖的可能作用机制。方法 通过腺病毒介导将外源性p2 1基因转入HVSMC ,利用印迹杂交分析、荧光染色分析等对p2 1基因的表达、靶细胞增殖抑制及凋亡、组织型转谷氨酰胺酶 (tTG)的表达进行分析。结果 外源性p2 1基因高水平的表达显著抑制了靶细胞的增殖 (P <0 .0 1) ,tTG表达的显著升高及荧光染色检测均提示靶细胞发生了凋亡。结论 p2 1基因的过度表达可诱导HVSMC凋亡并能抑制其增殖 ,这一过程可能与tTG的高表达有关。
- 张学利张群华余波王铁平张延龄蔡端李平朱运松
- 关键词：P21基因基因转移组织型转谷氨酰胺酶脱噬作用血管平滑肌细胞
- 血清诱导95D细胞中Nm23H1从细胞质转位至细胞膜板状伪足
- 2005年
- 目的 探索Nm2 3H1(肿瘤转移抑制因子之一)在细胞内的定位与其功能关系。方法 以人肺巨细胞癌95D细胞为模型,在血清饥饿2 4h后加入血清,观察细胞形态变化及Nm2 3H1在细胞内的分布变化。结果 血清刺激可以诱导95D细胞形成板状伪足,细胞免疫荧光实验发现Nm2 3H1主要分布于细胞质,但在血清诱导形成的细胞板状伪足部位出现显著的Nm2 3H1分布。亚细胞组分分离及免疫印迹的实验结果也证实Nm2 3H1在血清刺激下可以转位到细胞膜,并且这种诱导作用是迅速的,在30min左右达到高峰,8h后降至仍然略高于血清诱导前的水平。结论 Nm2 3H1这种特殊的定位可能涉及细胞的运动,为进一步研究Nm2 3H1的功能与作用机制提供了基础。
- 谭理李平孙兴会李春阳童畅樊静朱运松
- 关键词：NM23H1血清诱导细胞膜细胞质转位人肺巨细胞癌
- 腺病毒介导的uPAR反义核酸转移抑制肿瘤细胞的侵袭
- 2003年
- 为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPARcDNA 5′端 -4 6bp～ +45 4bp一段长 5 0 0bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno X中,构建出重组腺病毒载体pAdeno X uPAR( - )和pAdeno X uPAR( +).线性化后的重组腺病毒载体转染HEK2 93细胞 7天后,可以获得滴度分别为 1 5× 10 8pfu/ml和 0 5× 10 8pfu/ml的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒,分别命名为Ad uPAR( -)和Ad uPAR( +).以不同的病毒感染指数(MOI)感染人肺巨细胞癌高转移株 95D肿瘤细胞,3天后用RNA印迹法可以检测肿瘤细胞uPAR正义和反义核酸表达水平,随着MOI的升高,Ad uPAR( - )感染的肿瘤细胞uPAR蛋白水平逐渐下降,肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降,而感染Ad uPAR( +)的肿瘤细胞无明显变化.结果表明,重组腺病毒可以表达uPAR正义和反义核酸,uPAR反义核酸可以明显抑制人肺巨细胞癌高转移株 95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力.
- 孙兴会谭理李平张宇清王霞侯敏宋后燕朱运松
- 关键词：腺病毒介导反义核酸肿瘤细胞腺病毒尿激酶受体
- Lys_(10)-PAI-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和凝胶阻滞实验被引量：5
- 2003年
- 用PCR方法构建 10个赖氨酸与纤溶酶原激活剂抑制物 1的融合基因Lys10 PAI 1,并克隆于pET2 8a(+ )和pET32a(+ )原核表达载体 .将重组表达质粒pET32 PAI和pET2 8 PAI转化大肠杆菌BL2 1(DE3) .IPTG诱导后可获得分子量分别为 6 3kD和 4 3kD的目的蛋白 ,表达蛋白占菌体蛋白2 0 %以上 ,大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物经变性、复性、超滤、透析和亲和层析等步骤 ,可以得到纯化的Trx·PAI 1和rPAI 1重组蛋白 .Western印迹结果表明 ,目的蛋白具有人PAI 1的抗原性 .凝胶阻滞实验发现 ,纯化的重组蛋白在一定条件下 ,可以与质粒结合 ,使质粒的迁移率明显改变 .研究结果表明 ,Trx·PAI 1和rPAI
- 孙兴会李平张宇清谭理王霞侯敏陈怡韵朱运松
- 关键词：纤溶酶原激活剂抑制物-1融合基因纯化
- PAI-2在细胞内的定位影响其抗凋亡的活性
- 2003年
- 目的 为了进一步了解纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在细胞内的定位对其抗凋亡活性的影响。方法 构建绿色荧光蛋白质(EGFP)与PAI-2入核突变体融合蛋白质的表达质粒;转染HeLa细胞,荧光显微镜下比较野生型PAI-2与PAI-2的入核突变体在HeLa细胞内分布的差异;用MTT法检测PAI-2入核突变体抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导细胞凋亡的活性。结果 在核定位序列的引导下,几乎所有的PAI-2都进入了细胞核,而野生型PAI-2则弥散分布于HeLa细胞内。MTT法检测发现,当PAI-2被定位于细胞核内时,丧失其抗凋亡的功能。结论 PAI-2在细胞内的定位能影响其抗凋亡的活性,并且当用TNF-α诱导HeLa细胞凋亡时,野生型PAI-2在细胞内的分布没有发生明显的改变。
- 张宇清侯敏王霞孙兴会李平朱运松
- 关键词：PAI-2肿瘤坏死因子-Α细胞凋亡
- 腺病毒介导p21基因转染抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究被引量：1
- 2003年
- 目的 研究抗增殖性p21基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞(HVSMC)的增殖抑制作用及其作用机制。方法 通过腺病毒介导将外源性p21基因转入HVSMC,通过免疫印迹法(Western blot)检测p21基因的表达,原位末端标记法(TUNEL)、DNA片段梯度分析及流式细胞分析(FCM)观察靶细胞的细胞周期变化及凋亡,利用酶联免疫光度仪分析靶细胞的增殖抑制情况。结果 Western blot结果显示p21基因转染后的HVSMC可高水平表达p21蛋白,而另两组无表达。感染后5 d,Adp21组的细胞数为0.275 5±0.01(525 nm波长下吸光度A值),AdlacZ组为0.340 9±0.02,空白组为0.347 5±0.02,Adp21组较另两组的差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL、DNA片段梯度分析及FCM检测均提示靶细胞发生了凋亡。FCM检测还发现明显的细胞周期阻滞现象,Adp21组G0-G1期细胞比例为66.23％,S期细胞比例为10.18％,而另两组G0-G1期和S期细胞比例分别为:47.73％、30.56％和45.31％、32.34％。结论 复制缺陷性腺病毒在体外可有效介导外源性p21基因转染HVSMC,转染后的细胞除发生细胞周期阻滞外还出现明显的凋亡,其生长增殖受到抑制。
- 余波张学利王铁平李平蔡端
- 关键词：P21基因人血管平滑肌细胞静脉移植血管成形术
