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TALENs:一种新的基因定点修饰技术被引量：9: 2013年; 转录激活因子样效应蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN),由TALE(transcription activator-like effector)结构域和Fok I核酸内切酶结构域人工融合而成,它是近几年发展起来的一种可对基因组定点改造的新技术。TALEN能够特异识别一段DNA序列,并能够对双链DNA进行切割,TALEN造成DNA断裂后可以启动细胞对DNA的修复,从而实现特定位点的基因操作如基因敲除、基因敲进、基因修复等。相比ZFNs,TALENs的获得更为容易、效果更为明显,它在理论上真正实现了对任意序列进行基因操作的可能。综述了TALEN技术的研究发展过程、结构与作用机制、构建TALEN的方法,以及目前这一技术的应用等。; 张金脉任兆瑞; 关键词：TALEN

稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立被引量：1: 2013年; 在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.; 方彧聃何佳平张斯敏王娟任晓叶张金脉张敬之; 关键词：催乳素乳腺生物反应器

乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建: 2014年; 乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法:构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ(pCAG-loxPPolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ)。转染细胞实验结果:PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞(HC11)中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论:构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。; 张斯敏高越方彧聃张金脉张敬之; 关键词：乳腺生物反应器 CRE 特异表达

一步法快速构建多片段连接的同源臂载体被引量：5: 2013年; 目的：建立一种简便、高效，可一步完成多个片段连接，从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物，在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例，PCR扩增打靶用左右同源臂片段、示踪基因CMV-EGFP片段、载体骨架pMD19－T等4个片段，纯化后一起加入一个反应管中，并加入BsaⅠ限制性内切酶和T7DNA连接酶及相应缓冲液，进行酶切、酶连接共10～50个循环反应，一步构建含同源臂载体的质粒；产物经高温处理后，直接转化感受态细胞，并进行重组子PCR鉴定；对pMD19－T载体进行优化，突变载体上的BsaⅠ酶切位点，把示踪基因CMV-EGFP片段引入pHSG298－T载体，再选择不同的G160基因同源臂片段组合对构建系统进行验证。结果：重组质粒酶切和PCR结果表明，应用一步法可成功连接多个片段来构建含同源臂及示踪基因的克隆载体；用优化后的pMD19－T－O载体体系，在2d内即完成了6种各含4个片段的载体的构建。结论：多个基因片段一步无缝连接的方法简便、易行、可靠，不仅可快速构建某类载体系统，还可对基因进行精确的点突变，该系统可用于快速构建基因打靶载体。; 张金脉杨冠恒程艳黄英

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张金脉