刘志君
- 作品数：19 被引量：65H指数：4
- 供职机构：第三军医大学大坪医院野战外科研究所更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金烧伤与复合伤国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体基因突变对小鼠骨髓基质细胞发育的影响被引量：1
- 2007年
- 目的:观察对比野生型小鼠和成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体突变型小鼠骨髓基质细胞体外培养的生长情况以及成骨潜能,探讨成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能持续增强对小鼠骨髓基质细胞发育的影响。方法:实验于2005-09/2006-02在解放军第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所创伤中心实验室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。①实验动物:将雄性成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体S252W突变小鼠(由陈林教授在美国国立卫生研究院建立后引入本实验室)和雌性C57BL/6J小鼠(由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供)交配,经过基因型鉴定的雄性F1代8周龄小鼠按照基因型分为野生型组和突变型组,12只/组。②实验方法:将两组小鼠脱臼处死后分离胫、股骨,用DMEM培养液冲出骨髓,离心后弃上清,加入DMEM低糖培养液制成细胞悬液,贴壁法分离培养骨髓基质细胞,以1×108 L-1密度传代。③实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞形态及贴壁生长情况。采用MTT法检测两组骨髓基质细胞的增殖情况。检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性。采用Vankossa染色检测体外成骨诱导条件下两组骨髓基质细胞的钙结节形成能力。结果:①形态学观察:倒置相差显微镜下两组骨髓基质细胞形态变化相似。第3代骨髓基质细胞在体外诱导成骨条件下增殖速度明显减慢,多数细胞由梭形变成长方形,并逐渐成为立方形,细胞体积增大。②生长曲线:野生型组骨髓基质细胞的吸光度值在接种后2d内变化不大,细胞处于潜伏期,第4天显著增加,第6天达高峰,进入平台期。与野生型组比较,突变型组骨髓基质细胞生长曲线出现右移和平台期滞后。③碱性磷酸酶活性:在体外诱导成骨条件下,野生型组骨髓基质细胞随培养时间延长碱性磷酸酶活性逐渐上升,第9～15天达高峰,然
- 尹良军杜晓兰刘志君鲁秀敏张宜华杨京赵玲陈林
- 关键词：成纤维细胞生长因子受体基因突变骨髓基质细胞细胞培养
- 成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体功能获得型点突变影响小鼠颅底软骨发育被引量：1
- 2007年
- 目的:对比野生型小鼠和成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体(fibroblast growth factor receptor2,fgfr2)基因S252W突变型小鼠颅底软骨的生长发育情况,探讨fgfr2功能持续增强对小鼠颅底软骨发育的影响。方法:实验于2004-03/2005-04在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心实验室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。①fgfr2+小鼠和C57BL/6J小鼠交配后取F1代,利用聚合酶链反应方法进行fgfr2突变型小鼠基因型的鉴定,得到野生型和fgfr2受体功能获得型点突变型两组小鼠。②标本取材及处理:分别在两组实验动物中,取胚胎期16d(E16)、胚胎期17d(E17)、新生2d(P2)、新生8d(P8)的小鼠的颅底作为标本。一部分体积分数为0.75的乙醇溶液固定。另一部分标本行40g/L多聚甲醛固定,150g/L乙二胺四乙酸溶液脱钙,常规石蜡包埋、切片。③阿尔辛-茜素红骨架染色显示颅底整体骨骼的发育情况。软骨组织染为蓝色,骨组织染为红色。④脱钙骨切片后进行苏木精-伊红染色。未脱钙骨切片后进行Calcein染色,荧光显微镜下观察钙化组织的情况。⑤使用地高辛RNA标记试剂盒按照产品说明制备Col 10(Collagen 10)地高辛标记的互补RNA探针,对颅底软骨联结进行检测软骨分化标志基因表达情况的原位杂交。⑥组织切片染色结果使用SPOT Advanced软件进行数码拍摄。结果:①实验小鼠颅底发育的大体情况:fgfr2受体功能获得型点突变小鼠从胚胎后期开始就表现出短颅现象。②阿尔辛蓝-茜素红骨架染色、Calcein染色和苏木精-伊红染色显示,fgfr2受体功能获得型点突变小鼠出生后颅底软骨联结没有出现提前融合的现象,但是颅底软骨生长发育差,软骨细胞增生区、肥大区缩短。突变小鼠的颅底软骨发育障碍导致颅底骨组织的生长发育也出现障碍。③原位杂交:Col10在野生型和突变型小鼠颅底软骨的表达部位未�
- 尹良军杜晓兰刘志君苏楠张宜华杨京金琝赵玲陈林
- 关键词：成纤维细胞生长因子受体软骨细胞
- 小鼠HAX-1基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定被引量：3
- 2006年
- 目的构建小鼠Hax-1基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行系统性红斑狼疮模型BXSB小鼠的体内实验研究。方法用RT-PCR方法扩增小鼠全长Hax-1基因,经T/A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度。RT-PCR鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后Hax-1的表达,同时进行野生型腺病毒的检测。结果经酶切及测序证实Hax-1基因重组腺病毒载体构建成功。PCR检测转染后AD-293细胞内Hax-1基因水平的表达,且无野生型腺病毒的产生。结论成功构建了含小鼠Hax-1基因的重组腺病毒载体,为探讨Hax-1的生物学功能奠定了基础。
- 翟志芳郝飞刘志君钟白玉王鹰
- 关键词：腺病毒细胞凋亡
- 难愈性创面修复局部人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建与评价被引量：1
- 2005年
- 目的:克隆人血管内皮生长因子165cDNA并构建其真核表达载体,为放创复合伤的难愈性创面的促愈修复提供实验基础。方法:实验于2001-09/2003-05在第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。从白血病HL-60细胞提取总RNA,经过反转录-聚合酶链反应扩增编码人血管内皮生长因子165的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体后进行测序鉴定,然后将该序列插入双顺反子的真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。观察以下指标①反转录-聚合酶链反应扩增人血管内皮生长因子165cDNA。②阳性重组质粒pMD18-T-hVEGF165的筛选。③DNA测序鉴定。④阳性重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165的筛选。结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到约600bp的目的DNA片段,酶切pMD18-T-hVEGF165得一与目的片段大小一致的条带,且测序分析其与GeneBank中报道的编码人血管内皮生长因子165cDNA序列完全一致。pIRES2-EGFP-hVEGF165的酶切电泳显示目的条带成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中。结论:成功构建了含有人血管内皮生长因子165cDNA的真核表达载体,如果通过转基因技术可提高血管内皮生长因子165在放创复合伤难愈性创面的局部的表达,有望为修复难愈创面开辟一条新的途径。
- 刘志君徐辉冉新泽许川山
- 关键词：血管生成因子
- 人β防御素2腺病毒表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞中的表达被引量：7
- 2006年
- 目的构建和鉴定人β防御素2(HBD2)的重组腺病毒表达载体,并观察其转染大鼠真皮多能干细胞(dMSCs)后的表达。方法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HBD2全长cDNA,亚克隆至穿梭质粒(pAdTrack-CMV)中,然后转化含骨架质粒(pAdEasy-1)的大肠杆菌B J5183,通过同源重组产生腺病毒载体质粒。PacⅠ酶切阳性的重组质粒后转染293细胞,包装出重组病毒载体。用所得重组腺病毒感染dMSCs细胞,并采用RT-PCR和荧光免疫组织化学检测其在dMSCs中的表达情况。结果经测序、酶切及聚合酶链反应(PCR)鉴定,表明已成功地扩增到HBD2全长cDNA,并将其顺序克隆到穿梭质粒和骨架质粒中,进而组装出腺病毒表达载体。经RT-PCR和免疫组织化学证实构建的病毒载体可感染dMSCs,并有效表达HBD2。结论本实验成功地构建了含HBD2基因的腺病毒表达载体,并证实其可在dMSCs中表达。
- 李楠肖桃元粟永萍宗兆文徐辉王军平冉新泽刘志君
- 关键词：人Β防御素2腺病毒载体真皮多能干细胞
- VEGF165转染真皮多能干细胞及其对放创复合难愈性创面促愈的实验研究
- 放创复合伤多见于战时核爆炸和平时核事故,损伤后其伤口愈合主要表现为愈合过程的延迟甚至长期不愈合。尽管促进难愈性创面愈合的方法很多,如手术植皮、人工皮片应用、敷料促愈法、全身或局部药物应用、细胞因子局部应用等等,但已有的方...
- 刘志君
- 关键词：真皮多能干细胞VEGF165细胞工程血管生成创面愈合
- 文献传递
- 成纤维细胞生长因子受体3腺病毒载体的包装与鉴定
- 2007年
- 目的构建成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptors3,FGFR3)腺病毒载体,并进行鉴定、包装及表达检测。方法将小鼠FGFR3cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,通过电击转化使其在BJ5183细菌中与AdEasy-1同源重组,通过酶切及测序筛选阳性重组子。以脂质体介导法转染HEK293细胞进行包装、扩增并测定其滴度;并用RT-PCR及Western blot检测FGFR3在HT29细胞中的表达。结果经限制性内切酶检测、测序鉴定和细胞转染后GFP的表达等证实成功地构建了携带FGFR3cDNA的重组腺病毒载体并制备出有感染能力的高滴度重组腺病毒。将构建的腺病毒重组子转染HT29细胞,RT-PCR及Western blot均检测到FGFR3的表达。结论成功地构建了含有FGFR3cDNA的重组腺病毒载体并在HT29中表达了小鼠FGFR3分子,为进一步研究FGFR3的功能及其在骨折愈合中的作用提供有效的基因转移载体。
- 刘志君陈林
- 关键词：FGFR3腺病毒转染
- 转化生长因子-β与创伤愈合被引量：11
- 2004年
- 刘志君徐辉
- 关键词：转化生长因子-Β转化生长因子-Β受体伤口愈合
- 干细胞的研究及应用前景被引量：19
- 2003年
- 干细胞是存在于生命个体中的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体。它们不仅存在于胚胎发育时期而且在成体内也广泛分布于各种组织器官的特定部位,故宏观上将其分为胚胎干细胞(ES细胞)和成体干细胞。其中ES细胞具有分化全能性,可以分化成任一机体组织细胞,它的主要功能是参与机体的发育;成体干细胞的分化潜能则相对有限,其功能主要是维持组织器官的新陈代谢。随着细胞替代治疗的发展,干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段,利用干细胞在体外扩增培养并诱导成所需要的细胞后移植入患者体内,用于组织损伤的修复、退行性器官的替代及改善遗传性缺陷组织器官的功能。而成体干细胞可塑性分化的发现,为细胞替代治疗提供了新的种子细胞。
- 刘志君徐辉
- 关键词：干细胞造血干细胞移植ES细胞
- 重组人Β防御素2在真皮多能干细胞中的表达及抗菌活性的测定被引量：2
- 2006年
- 目的检测重组人Β防御素2(HUMANΒ-DEFENSIN2,HBD2)腺病毒表达载体在大鼠真皮多能干细胞(DERMALMULTIPOTENT STEM CELLS,DMSCS)中的表达,并观察重组HBD2的体外抗菌活性。方法将含有HBD2重组腺病毒转染DMSCS,RT-PCR、荧光免疫化学、WESTERN BLOTTING检测HBD2的表达情况,ELISA测定培养上清中HBD2的浓度,K-B纸片扩散法检测上清对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等标准菌株的杀灭效果。结果RT-PCR、荧光免疫化学和WESTERNBLOTTING的结果显示转染后HBD2可在DMSCS中有效地表达,上清中HBD2的浓度为743.6NG/ML,K-B纸片法显示HBD2对上述标准菌株有明显的杀灭效应。结论HBD2重组腺病毒表达载体在DMSCS可高效表达,并对大肠埃希菌等标准菌株有杀灭效应。
- 李楠肖桃元粟永萍徐辉王军平宗兆文冉新泽董世武刘志君
- 关键词：人Β防御素2真皮多能干细胞
