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韩晓凤: 作品数：11 被引量：15H指数：3; 供职机构：重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室更多>>; 发文基金：国家自然科学基金重庆市高等学校优秀人才支持计划教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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腺病毒介导人ATF6基因修饰对体外细胞增殖凋亡的实验研究: 2015年; 目的:构建携带人活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)的重组腺病毒Ad-ATF6和Ad-ATF6 si RNA,并探讨内质网应激(ER Stress,ERS)时其对人软骨肉瘤细胞SW1353增殖凋亡的影响。方法:将ATF6基因序列与靶向ATF6的si RNA序列分别克隆到p Ad Track-cmv和p SES-HUS穿梭质粒上,然后分别与腺病毒骨架质粒p Ad Easy-1在大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组,得到腺病毒重组质粒p Ad-ATF6和p Ad-ATF6 si RNA,通过脂质体介导在HEK293细胞中进行包装和扩增。通过RT-PCR和Western blot检测病毒效果。流式细胞仪法(flow cytometry,FCM)、MTT法及Western blot检测ERS状态下ATF6对SW1353细胞增殖凋亡的影响。结果:成功获得了重组腺病毒Ad-ATF6和Ad-ATF6 si RNA。RT-PCR和Western blot结果表明,重组腺病毒能有效的感染细胞。FCM检测结果表明,ERS条件下,ATF6感染组S期细胞比例明显升高,凋亡率明显降低(P=0.000);Ad-ATF6 si RNA感染组S期细胞比例明显降低,凋亡率明显上升(P=0.000)。MTT与Western blot实验结果与FCM结果一致。结论:ERS状态下,ATF6能促进SW1353细胞的增殖,抑制其凋亡。; 韩晓凤李美玲夏飞张鹏郭风劲; 关键词：重组腺病毒

慢病毒介导人PERK基因修饰对内质网应激介导凋亡的影响: 2014年; 目的构建人蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)慢病毒载体并包装慢病毒颗粒(lentivirus),探讨成肌细胞C2C12中PERK基因慢病毒修饰对内质网应激介导凋亡的作用。方法设计并合成人PERK基因的上、下游引物,采用PCR方法从真核质粒pcDNA3.l(-)-PERK中扩增目的基因。鉴定后与慢病毒载体pWPT-GFP进行重组,再将重组慢病毒载体pWPT-GFP-PERK与慢病毒包装质粒pMD2G、pSPAX2共转入293T细胞中,进一步包装形成PERK慢病毒(LV-PERK);收集转染后48h的细胞上清,体外感染成肌细胞C2C12,观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪(FCM)检测内质网应激时重组慢病毒PERK对C2C12细胞增殖凋亡的影响,蛋白质印迹法检测凋亡相关基因Cleaved Caspase-3与Chop蛋白的表达。结果成功构建和包装了滴度为4.2×108 efu/mL的PERK重组慢病毒。FCM检测结果表明,TM+LV-PERK处理组G1期细胞比例为54.37%,低于TM组(77.91%)和LV-GFP组(66.41%);TM+LVPERK处理组S期细胞比例为31.36%,高于TM组(12.14%)和LV-GFP组(16.96%),各组差异均具有统计学意义(P<0.05);此外,TM+LV-PERK处理组细胞凋亡率为25.91%,高于TM组(11.79%)和Ad-GFP组(11.24%),各组差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹检测Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致。结论成功构建和包装LVPERK重组慢病毒颗粒,在内质网应激时,LV-PERK慢病毒可促进C2C12细胞的增殖和凋亡。; 张鹏夏飞李美玲韩晓凤郭风劲; 关键词：PERK 慢病毒成肌细胞内质网应激

IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响被引量：5: 2013年; 目的构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-IRE1α、pAd-R+K。随后在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad-IRE1α、Ad-R+K。用直接PCR法鉴定重组腺病毒,后者体外感染软骨干细胞ATDC5,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪分别检测在内质网应激(ERS)和非ERS状态时重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响。结果酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd-IRE1α、pAd-R+K。流式细胞仪检测结果显示,在ERS状态时,重组腺病毒质粒Ad-IRE1α、Ad-R+K感染后ATDC5细胞G1期比例明显降低,S期细胞比例明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。结论含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5细胞的增殖和凋亡。; 李祥柱张鹏韩晓凤李美玲夏飞郭风劲; 关键词：腺病毒科细胞增殖细胞凋亡

BiP调控IRE1启动子转录活性及蛋白表达的效应被引量：4: 2013年; 正常条件下,外分泌或者跨膜的蛋白需要在内质网中完成正确的折叠。在营养缺乏、分化或其他应激状态下,内质网中的蛋白质会发生错误折叠并不断积聚,形成内质网应激(Endoplasmic reticulum stress),引发未折叠蛋白反应(Unfolded protein response)。内质网应激条件下,内质网腔中的分子伴侣结合免疫球蛋白BiP(Binding immunoglobulin protein)与需肌醇酶IRE1(Inositol-requiring kinase 1)解离并与未折叠蛋白结合从而帮助蛋白形成正确结构;同时未折叠蛋白通过与跨膜蛋白IRE1直接结合活化其内切核糖核酸酶结构域,活化的IRE1能够剪切Xbp1的mRNA使其形成有活性的转录因子进而起始分子伴侣与未折叠蛋白反应相关蛋白的表达使细胞脱离内质网应激状态。文章克隆了IRE1的启动子用荧光素酶报告基因法检测到BiP能够上调IRE1的启动子活性。通过构建IRE1启动子一系列截短体的报告基因载体确定了IRE1启动子活性的核心区域进一步通过逆转录PCR和免疫印迹在mRNA水平和蛋白水平分别检测BiP对IRE1启动子的调控作用。结果发现在内质网应激条件下分子伴侣BiP通过上调IRE1启动子转录活性增加IRE1的表达进而提高细胞处理内质网应激时未折叠蛋白的能力为揭示内质网应激条件下BiP调控IRE1转录调控机制提供理论依据,同时为阐明ER stress各信号分子之间的作用机制奠定实验基础。; 周菁华韩晓凤刘艳娜张鹏郭风劲; 关键词：BIP 内质网应激未折叠蛋白反应

siIRE1α重组腺病毒构建及对C2C12细胞增殖凋亡的影响: 目的构建内质网跨膜蛋白肌醇酶1 α (inositol-requiring enzyme 1α,IRE 1 α)基因干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒,在小鼠成肌细胞系C2...; 韩晓凤李美玲张鹏夏飞郭风劲; 关键词：RNA干扰重组腺病毒 C2C12细胞

siIRE1α重组腺病毒对内质网应激介导凋亡的影响被引量：2: 2014年; 目的构建内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒,并探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)状态下其对C2C12细胞增殖凋亡的影响。方法人工合成靶向IRE1α的siRNA序列,连接到穿梭载体pSES-HUS上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183感受态中进行同源重组,得到pAdSES-HUS-IRE1αsiRNA重组质粒。通过脂质体介导在HEK293细胞中包装并扩增重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA,在C2C12细胞中采用RT-PCR和Western blot检测其干扰效果,并通过FCM法和MTT检测Tm诱导ERS时病毒对C2C12细胞增殖凋亡的影响(分为4组:NC组、Tm单独处理组、Tm+Ad-RFP组和Tm+AdIRE1αsiRNA组),Western blot检测C2C12细胞中Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达。结果成功获得了病毒滴度约为4.3×1011PFU/mL的重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA。RT-PCR和Western blot检测结果表明,该重组腺病毒有效地抑制了C2C12细胞中IRE1α的表达。FCM检测结果表明,ERS条件下,Tm+Ad-IRE1αsiRNA组S期的细胞比例分别比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组升高12.62%和14.80%(P<0.05);凋亡率比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组降低16.64%和16.26%(P<0.05)。MTT实验结果与Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致。结论重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA在C2C12细胞中能有效抑制IRE1α的表达;ERS状态下,RNA干扰IRE1α基因可促进C2C12细胞的增殖,抑制其凋亡。; 韩晓凤李美玲张鹏夏飞郭风劲; 关键词：RNA干扰重组腺病毒 C2C12细胞

Bip调控IRE1启动子转录活性及蛋白表达的效应: 内质网应激条件下,内质网腔中的伴侣分子结合免疫球蛋白Bip(Binding immunoglobulin protein)与需肌醇酶IRE1(Inositol-requiring kinase 1)解离并与未折叠蛋白结合...; 周菁华韩晓凤刘艳娜张鹏郭风劲

携人ATF6重组腺病毒载体的构建及对C28I2细胞增殖及凋亡的影响被引量：3: 2013年; 目的构建携带人活化转录因子6（ activating transcription factor 6, ATF6）的重组腺病毒，观察其对软骨细胞C2812增殖及凋亡的影响。方法将ATF6基因克隆人pAdTrack-cmv质粒，经pme I线性化后的重组穿梭质粒pAdTrack-ATF6通过电转法与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183感受态中同源重组．挑选阳性克隆，获得重组腺病毒质粒pad-ATF6。通过脂质体介导转染HEK-293细胞。得到重组腺病毒Ad-ATF6，并采用PCR法对重组腺病毒进行鉴定。Ad-ATF6感染软骨细胞C2812．通过Western印迹检测ATF6的表达，并应用流式细胞仪检测Ad-ATF6对C2812细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建了携带人ATF6基因的重组腺病毒质粒，并成功包装了具有高效感染力的Ad-ATF6腺病毒。Western印迹结果表明．Ad-ATF6感染组ATF6的表达明显增加。FCM检测结果表明，Ad-ATF6处理组G，期的细胞比例分别比Nc组和Ad-GFP组高28．42％和30．50％（P〈0．5）．S期的细胞比例分别比Nc组和Ad-GFP组低22．43％和24．10％（P〈0．5）；凋亡率比Nc组和Ad-GFP组高出21．98％和19．65％（P〈0．5）。结论可高表达ATF6的腺病毒包装成功，感染C2812细胞后。抑制了C2812细胞的增殖并促进其凋亡．为后续研究AqT6基因的生物学功能奠定了基础，为与内质网应激相关的软骨发育疾病提供了一定的参考价值。; 韩晓凤张鹏李美玲夏飞郭风劲; 关键词：重组腺病毒细胞增殖凋亡

ATF6腺病毒的构建及对软骨细胞凋亡的研究: 目的：　　构建携人ATF6基因的重组腺病毒Ad-ATF6和siATF6，并探讨其对软骨细胞凋亡的影响。为进一步研究ATF6基因的生物学功能奠定基础，为与ERS相关的软骨发育疾病提供一定的参考价值。　　方法：　　利用AdE...; 韩晓凤; 关键词：重组腺病毒生物学功能

Ad—XBP15重组腺病毒对ATDC5细胞周期与凋亡的效应研究被引量：2: 2012年; 目的构建重组人剪接型X盒结合蛋白1（X—boxbindingprotein1spliced，XBP1S）并探讨其对软骨祖细胞ATDC5周期和凋亡的影响。方法应用pAdEasy“腺病毒载体系统，构建得到XBP1S基因全长的重组穿梭质粒pAdTrack—XBP1S，通过电转法同腺病毒骨架质粒pAdEasy—1进行同源重组，获得重组腺病毒pad．XBP1S。随后在HEK-93细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad—XBP1S。用直接PCR法鉴定重组腺病毒。体外感染软骨祖细胞ATDC5，观察绿色荧光蛋白（GFP）感染效率，并应用流式细胞仪（FCM）分别在加入毒胡萝卜素（tunicamycin，TM）和不加入TM的条件下，检测重组腺病毒Ad—XBP1S对ATDC5细胞周期和凋亡的影响。结果酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd．XBP1S。FCM检测结果表明，在ERS条件下，Ad—XBP1S实验组ATDC5细胞G，（60．70％）期细胞比例低于TM（87．78％）、Ad。GFP对照组（85．24％）（P〈0．05），Ad—XBP1S实验组ATDC5细胞S期（26．64％）高于TM（6．69％）、Ad—GFP对照组（7．35％）（P〈0．05）；TM刺激诱导ERS条件下，感染Ad—XBP1S腺病毒上清后，ATDC5细胞的凋亡率为7．81％，与TM（33．32％）、Ad—GFP对照组（25．95％）比较，差异具有显著性（P〈0．05）。结论含XBP1S基因的重组腺病毒感染ATDC5细胞后，可加速ATDC5细胞周期的转化并抑制其凋亡。为后续研究XBP1S生物学功能奠定了基础。; 刘艳娜周菁华张鹏韩晓凤郭风劲; 关键词：重组腺病毒细胞凋亡增殖

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