周菁华
- 作品数：11 被引量：24H指数：4
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- Ad-XBP1S重组腺病毒对ATDC5细胞周期与凋亡的效应
- 应用pAdEasy~(TM)腺病毒载体系统,构建得到XBP1S基因全长的重组穿梭质粒pAdTrack-XBP1S,通过电转法同腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-XBP1S。随后在HEK-...
- 刘艳娜周菁华张鹏韩晓凤郭风劲
- 内质网分子伴侣BiP缺失突变体的构建及生物信息学分析
- 免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP),又称GRP-78或HspA5,是位于内质网(ER)的重要分子伴侣,属于热休克蛋白(Hsp70)家族成员之一.BiP与许多内质网蛋白都有短暂的相互作用,是内质网维持内环境稳态的一个感应器,...
- 李祥柱赵文君刘平刘艳娜周菁华郭风劲
- 关键词：内质网分子伴侣BIP生物信息学重叠PCR
- BiP对IRE1α基因的调控及对软骨细胞凋亡的影响
- 目的: 内质网应激条件下，内质网腔中的伴侣分子结合免疫球蛋白BiP(Binding immunoglobulin protein)与需肌醇酶IRE1α(Inositol-requiring kinase1)解离并与未折叠...
- 周菁华
- 关键词：内质网应激软骨细胞凋亡基因重组免疫印迹
- Bip调控IRE1启动子转录活性及蛋白表达的效应
- 内质网应激条件下,内质网腔中的伴侣分子结合免疫球蛋白Bip(Binding immunoglobulin protein)与需肌醇酶IRE1(Inositol-requiring kinase 1)解离并与未折叠蛋白结合...
- 周菁华韩晓凤刘艳娜张鹏郭风劲
- 靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响被引量：1
- 2012年
- 目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA，分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2，依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平，免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达；MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达；成功转染后，细胞处于内质网应激（ER stress）状态时，各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较，差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2，有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达；细胞处于ERS状态时，IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖；抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。
- 姜蓉刘艳娜周菁华刘平郭风劲
- 关键词：SHRNA细胞增殖
- 分子伴侣BiP结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响被引量：5
- 2011年
- 结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BiP),是Hsp70(70 kilodalton heatshock proteins)蛋白家族的成员之一,是内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)主要的调节器。为了研究BiP的分子结构与生物学功能的关系,首先,分析BiP的DNA序列和蛋白质空间构象,接着利用重叠PCR方法分别克隆ATPase结构域缺失体和peptide-binding结构域缺失体(BiPa和BiPp),成功构建带myc标签的真核表达载体,转染LO2细胞和SMMC-7721细胞,应用免疫印迹方法检测其在细胞内的表达;运用MTT法、BrdU免疫组化法及流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡;检测BiP及两个组成结构域对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。酶切、电泳和DNA测序结果显示,BiP全长和两个缺失体的真核表达载体构建成功;免疫印迹检测到BiP三种真核载体在LO2细胞和SMMC-7721细胞中均能正确表达;MTT和BrdU免疫组化结果表明,BiP全长和缺失体BiPa、BiPp三种真核载体均能有效促进SMMC-7721的增殖,各组间细胞增殖率结果分析提示ATPase功能域可能抑制细胞增殖,而peptide-binding结构域可能促进细胞的增殖;流式细胞仪结果显示,转染BiP、BiPa、BiPp三种真核载体均可以促进SMMC-7721的凋亡,缺失体BiPa与全长BiP组间凋亡率差异不显著;而缺失体BiPp组细胞凋亡率明显低于全长BiP组,两组差异具有显著性(P<0.05);提示ATPase功能域与细胞凋亡可能不相关,而peptide-binding结构域可能促进细胞的凋亡。上述结果表明,BiP的两个组成结构域:ATPase功能域与peptide-binding结构域,独立存在或者共同存在时,调控细胞增殖与凋亡具有差异性;当两个结构域共同存在时,它们会协同调控细胞的增殖与凋亡,具体的分子机制还需要进一步的实验研究和探讨。
- 李祥柱刘艳娜赵文君周菁华郭风劲
- 关键词：BIP生物信息学细胞增殖
- IRE1结构域分析及截短型载体的构建和表达被引量：5
- 2011年
- 目的 克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法 应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测各重组载体在细胞中的表达,并利用SWISS-MODEL在线软件预测其蛋白结构.结果 酶切鉴定及Western 印迹结果表明成功构建了IRE1全长及每一种截短型片段的真核表达载体：pcDNA3.1（-）-IRE1（pIRE1）,pcDNA3.1（-）-IRE1-NLDP（pNLD）,pcDNA3.1（-）-IRE1-KinaseP（pKinase）,pcDNA3.1（-）-IRE1-R＋L（pR＋L）,pcDNA3.1（-）-IRE1-RNase（pRNase）.结论 IRE1及其截短型真核表达载体的成功构建和表达,为进一步研究IRE1各个结构域的生物学功能奠定了基础.
- 刘平李祥柱赵文君刘艳娜周菁华郭风劲
- 关键词：内质网应激结构域
- BiP调控IRE1启动子转录活性及蛋白表达的效应被引量：4
- 2013年
- 正常条件下,外分泌或者跨膜的蛋白需要在内质网中完成正确的折叠。在营养缺乏、分化或其他应激状态下,内质网中的蛋白质会发生错误折叠并不断积聚,形成内质网应激(Endoplasmic reticulum stress),引发未折叠蛋白反应(Unfolded protein response)。内质网应激条件下,内质网腔中的分子伴侣结合免疫球蛋白BiP(Binding immunoglobulin protein)与需肌醇酶IRE1(Inositol-requiring kinase 1)解离并与未折叠蛋白结合从而帮助蛋白形成正确结构;同时未折叠蛋白通过与跨膜蛋白IRE1直接结合活化其内切核糖核酸酶结构域,活化的IRE1能够剪切Xbp1的mRNA使其形成有活性的转录因子进而起始分子伴侣与未折叠蛋白反应相关蛋白的表达使细胞脱离内质网应激状态。文章克隆了IRE1的启动子用荧光素酶报告基因法检测到BiP能够上调IRE1的启动子活性。通过构建IRE1启动子一系列截短体的报告基因载体确定了IRE1启动子活性的核心区域进一步通过逆转录PCR和免疫印迹在mRNA水平和蛋白水平分别检测BiP对IRE1启动子的调控作用。结果发现在内质网应激条件下分子伴侣BiP通过上调IRE1启动子转录活性增加IRE1的表达进而提高细胞处理内质网应激时未折叠蛋白的能力为揭示内质网应激条件下BiP调控IRE1转录调控机制提供理论依据,同时为阐明ER stress各信号分子之间的作用机制奠定实验基础。
- 周菁华韩晓凤刘艳娜张鹏郭风劲
- 关键词：BIP内质网应激未折叠蛋白反应
- 内质网应激对ATF6调控XBP1启动子转录的影响被引量：11
- 2012年
- 目的确定XBP1启动子的转录核心区域,探讨激活转录因子6(ATF6)在内质网应激(ERS)与非ERS状态下对XBP1启动子转录活性的调控作用。方法采用基因重组技术构建ATF6基因及两个缺失体ATF6s1p、ATF6s2p的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ATF6、pcDNA3.1(-)-s1p、pcDNA3.1(-)-s2p,以及XBP1启动子报告基因载体pGL3-XBP1。针对XBP1启动子的各个组成元件设计和构建XBP1一系列截短体的报告基因载体。采用双荧光素酶报告基因法检测并确定XBP1启动子的核心启动子区,Western blotting检测ATF6及缺失体s2p、s1p在ERS与非ERS状态下对XBP1核心启动子区转录的调控作用。结果 XBP1启动子的-407bp-+133bp区域是转录活性调控的核心区域,-2000bp--407bp区域不具有转录活性,该区域可能含有抑制转录活性的组成元件。非ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p可明显上调XBP1启动子的转录活性及XBP1蛋白表达;而在ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p下调了XBP1启动子的转录活性和XBP1蛋白表达。结论 ATF6对XBP1的转录调控作用在ERS状态和非ERS状态下存在差异。非ERS状态时,ATF6上调XBP1的转录和表达,而ERS状态时,ATF6下调XBP1的转录和表达。
- 赵文君朱慧芳周菁华李祥柱刘艳娜郭风劲
- 关键词：基因表达调控转录启动子
- IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究被引量：3
- 2012年
- 目的研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响。方法在成功构建人IREla基因全长重组质粒的基础上，设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体（pS1；pS2）；采用巢式PCR扩增XBP1启动子，插入到pGL3．Basic载体，构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1。分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBPl报告基因重组质粒共转染人SW1353细胞和Saos-2细胞中，48h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用。结果酶切及测序结果证实siRNA1干扰质粒和XBPl启动子真核表达载体均构建成功，双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中，直接载体pcDNA3．15（-）IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组（P〈0．5），并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和；而silRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低。免疫印迹结果显示，过表达IRE1α明显上调剪接型XBPlS蛋白的表达。结论人恶性骨肿瘤细胞中，过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达，并能有效促进XBPIU剪切生成XBPIU；通过siRNA方法抑制IRE1α后，XBP1启动子的转录与表达受到抑制。本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础，为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据。
- 李祥柱赵文君刘艳娜周菁华郭风劲
- 关键词：转录活性骨肿瘤
