阳宇
- 作品数：3 被引量：0H指数：0
- 供职机构：四川大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 一种新型的通过免疫富集纯化溶酶体方法
- 2013年
- 用传统的密度浓度梯度法分离溶酶体具有耗时长,样品需求量大,而且无法得到纯度较高的溶酶体等不足,因此有必要开发一种简便分离溶酶体的方法。依据溶酶体膜蛋白LAMP2的特性,开创性地尝试用免疫富集溶酶体膜蛋白的方式纯化溶酶体:首先构建了带Flag标签的LAMP2真核表达载体,并转染Hela细胞,用免疫荧光鉴定其亚细胞定位情况,发现重组蛋白LAMP2-Flag特异性定位于溶酶体。在Hela细胞中筛选得到了稳定表达LAMP2-Flag的细胞系。大规模培养该细胞系,在非变性条件下分离细胞质提取物,利用anti-Flag抗体做免疫沉淀,用蛋白质免疫印迹检测,发现沉淀产物中特异性富集了溶酶体标识蛋白LAMP1。用糖苷酶活性检测,发现沉淀产物中酸化蛋白酶活性很高,表明富集到较纯的溶酶体。这种改良的新型方法步骤简捷,样品需求量少,获得的溶酶体纯度高,为从少量细胞中分离溶酶体提供了一个种优化方案。
- 张磊阳宇吴传芳
- 关键词：分子生物学
- 强化融合蛋白lhFⅦ-LDM对人肺腺癌细胞A549体内致瘤性的抑制
- 2014年
- 以人凝血因子Ⅶ(FⅦ)cDNA和编码力达霉素(LDM)辅基蛋白LDP的质粒(pETVH-LDP)为模板,通过PCR及搭桥PCR构建原核表达人凝血因子Ⅶ轻链(the light chain of FⅦ,lhFⅦ)和LDP融合蛋白lhFⅦ-LDP的重组质粒pET19b-lhFⅦ-LDP.重组质粒转化感受态表达菌株E.coli Rosetta-gami B(DE3)pLysS,诱导表达后亲和纯化,并以Western blot鉴定得到的融合蛋白lhFⅦ-LDP.将lhFⅦ-LDP与LDM的烯二炔发色团(AE)进行分子组装制备强化融合蛋白药物lhFⅦ-LDM.用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测lhFⅦ-LDP与人肺腺癌细胞A549组织因子(TF)的结合特异性,并通过裸鼠移植瘤实验研究lhFVⅡ-LDM对A549细胞体内致瘤性的影响.结果显示,lhFⅦ-LDP能够与TF特异性结合,并且,强化融合蛋白lhFⅦ-LDM能够显著抑制A549细胞的体内致瘤性.
- 廖东升阳宇陈金武马登佼李灵
- 关键词：A549细胞体内致瘤性
- SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段体外组装和siRNA干扰研究
- 2014年
- 为了安全便捷地获取严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus,SARS coronavirus)的RdRp基因,作者合成了26条寡聚核苷酸片段,利用组装PCR(assembly PCR)在体外构建了SARS病毒的RdRp基因片段,并建立了基于Vero E6细胞的SARS RdRp基因的稳定表达株.之后设计了4对针对SARS RdRp基因的siRNA,基因干扰表明这4对siRNA均能高效干扰SARS RdRp基因在Vero E6细胞中的表达.至此,本文提供了一种安全便捷地获取病毒基因的方法.
- 马成川谭光宏阳宇李灵
- 关键词：SARS冠状病毒RDRPDNA改组
