王路
- 作品数：10 被引量：36H指数：4
- 供职机构：中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室更多>>
- 发文基金：甘肃省自然科学基金国家科技基础条件平台建设计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学理学更多>>
- 马属动物梨形虫病的PCR鉴别诊断技术研究
- 龚真莉刘光远谢俊仁张丽艳柴慧萍李知新田占成王路刘建刚张林
- 驽巴贝虫病间接ELISA检测方法的建立被引量：8
- 2010年
- 目的克隆表达驽巴贝虫诊断抗原基因BC48,建立间接ELISA诊断方法。方法从感染驽巴贝虫的毛驴血液中提取虫体基因组DNA,利用PCR技术扩增BC48基因,将其克隆入表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化蛋白。以该蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA诊断方法 ,对反应条件进行优化,并对该方法的特异性和敏感性进行评价。结果扩增获得1272bp的BC48基因片段。重组表达质粒pET-28a-BC48诱导后获得大小约为Mr46000的可溶性融合蛋白,纯化后蛋白浓度为12.98mg/ml。间接ELISA方法条件优化的结果显示,最佳抗原包被浓度为65μg/ml,最适血清稀释度为1∶80,该融合蛋白可特异性地与驽巴贝虫感染血清结合,而不与马泰勒虫感染血清及阴性血清反应。使用该方法与镜检法检测17份散养毛驴血清样品,阳性检出率分别为3/17和2/17。结论以BC48重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于马属动物驽巴贝虫病的检测。
- 龚真莉刘光远谢俊仁柴慧萍张丽艳李知新田占成王路刘建刚
- 关键词：纯化ELISA
- 长角血蜱卵cDNA表达文库的构建被引量：6
- 2008年
- 【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo(dT)引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU·ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素(DQ248886)的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。
- 刘光远田占成才学鹏李知新谢俊仁王路张林龚真莉
- 关键词：长角血蜱CDNA表达文库
- 长角血蜱甘肃株肌钙蛋白基因P27/30的克隆和序列分析被引量：3
- 2007年
- 参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株肌钙蛋白P27/30基因的核苷酸序列,设计合成一对引物,从本实验室保藏的干净长角血蜱卵中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出607 bp的肌钙蛋白基因,将其克隆于PGEM-T-Easy载体,对其进行序列分析,并推导出氨基酸序列,将这一序列与国内外已发表的长角血蜱肌钙蛋白基因进行比较分析。结果表明本实验室保藏的长角血蜱甘肃株与上述已发表的Okayama株核苷酸序列同源性为92.1%,氨基酸同源性为86%。长角血蜱甘肃株与Okayama株、四川孤雌生殖株的发育有一定差异。经RT-PCR分析表明,该基因在长角血蜱的卵、幼蜱、若蜱和饥饿成蜱这几个阶段均有表达。
- 田占成刘光远李知新谢俊仁王路张林
- 关键词：长角血蜱克隆
- 实验室条件下长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生物学特性被引量：14
- 2007年
- 在实验室条件下，对我国北方长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生活史进行了首次观察。研究发现，行孤雌生殖的长角血蜱为三宿主蜱；在兔体完成1个世代共需106～154d，饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重的差异不显著（P〉0．05），而饱血体重与两性生殖的长角血蜱种群饱血体重差异极显著（P〈0．01）；雌蜱饱血体重可达吸血前的108．46±19．72倍，与两性生殖的种群饱血体重差异亦极显著（P〈0．01）。雌蜱产卵量与饱食体重之间呈极显著正相关r=0．8970（P〈0．01）；生殖效率指数REI=6．76，生殖适合度指数RFI=6．29；蜱发育时间在不同季节无明显变化。
- 李知新刘光远田占成谢俊仁王路龚真莉柴慧萍孙晓林
- 关键词：长角血蜱孤雌生殖生物学特性
- 长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核、真核表达及其结构的预测
- 长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是我国流行最广泛和最重要的蜱种之一，主要叮咬牛、羊以及多种脊椎动物，是病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌、原虫、支原体、以及衣原体等多种病原重要的传播媒介，主要影...
- 王路
- 关键词：长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因表达
- 文献传递
- 马属动物梨形虫病的PCR鉴别诊断技术研究
- 马属动物是国内仅次于牛和羊的主要家畜种群,在我国现有的农业生产条件下,马属动物依然是大部分农村(特别是山区和广大西部地区)的主要使役动物。目前,该动物的梨形虫病流行非常广泛,危害非常严重,给国民经济和人民生活造成极大的威...
- 龚真莉刘光远谢俊仁张丽艳柴慧萍李知新田占成王路刘建刚张林
- 关键词：马属动物梨形虫病PCR
- 文献传递
- 长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析被引量：9
- 2008年
- 蜱的免疫预防是目前国内外研究的热点,以抗血清为探针筛选cDNA表达文库是获取功能抗原基因的有效的方法之一,为了获得抗长角血蜱免疫原基因,用兔抗长角血蜱血清和兔抗长角血蜱唾液腺蛋白血清对长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库进行了免疫筛选,经过两轮筛选共获得34个阳性克隆,所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之亚克隆为重组质粒,用此质粒转化宿主菌JM109并进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:在长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库中获得26个长角血蜱免疫相关cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱HL35、黏附素hlim3假定蛋白、热休克蛋白、NADH脱氢酶、钙网蛋白以及杂色花蜱和肩突硬蜱的二硫异构酶等具有同源性.所获阳性克隆为长角血蜱保护性抗原基因的筛选奠定了基础.
- 刘光远谢俊仁田占成李知新龚真莉王路柴慧萍才学鹏
- 关键词：长角血蜱唾液腺CDNA表达文库免疫筛选
- 长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核表达被引量：2
- 2009年
- 根据GenBank中的长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂(Haemaphysalis longicornisserine proteinase inhibitor-2,HLS2)基因序列设计特异性引物,以长角血蜱饥饿成蜱总RNA为模板,经RT-PCR扩增出1 164 bp的HLS2DNA片段。将其与pET-30a载体连接,构建pET-30a-HLS2表达载体,转化J M109大肠杆菌,筛选阳性克隆,经双酶切鉴定及测序分析后转化到E.coliBL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析。优化表达条件后纯化融合蛋白,用Western blotting鉴定其抗原性。结果表明,获得的HLS2 DNA片段与GenBank中的HLS2(序列号AB162827)序列的同源性为98%。构建的pET-30a-HLS2表达载体在大肠杆菌中表达了约为47000的HLS2融合蛋白,主要以包涵体形式存在,IPTG终浓度为1.0 mmol/L、28℃诱导7 h后融合蛋白的表达量最高。Western blotting显示该融合蛋白可与兔抗长角血蜱阳性血清反应。
- 王路刘光远谢俊仁龚真莉田占成柴慧萍贾宁
- 关键词：长角血蜱原核表达
- 荧光检测碱性磷酸酶活力方法的建立被引量：1
- 2008年
- 以4-甲基伞形酮磷酸酯为底物，利用动力学模式，建立了一种检测碱性磷酸酶活力的荧光法。确定了荧光检测的最佳条件为：激发波长为365nm，发射波长为449nm，作用时间为第2～6min，pH值为9，底物体积为100μL，底物缓冲溶液浓度为0．1mol·L^-1。该法操作简便、快速。
- 惠永华韩立强杨国宇王路
- 关键词：荧光法碱性磷酸酶
