万晓珊
- 作品数：5 被引量：14H指数：2
- 供职机构：吉林农业大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：吉林省科技厅科技发展计划项目温州市科技计划项目吉林省科技发展计划基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 人成纤维细胞生长因子-21分泌型表达及鉴定被引量：9
- 2009年
- 利用基因工程手段,将人成纤维细胞生长因子-21(hFGF21)与分泌信号肽相融合,构建得到能够分泌表达FGF21蛋白的表达载体。将该表达载体导入到Rosetta(blue)宿主细胞中,在分泌信号肽的引导下,在细胞周质中表达。经IPTG诱导表达可获得分子量为21 kD的蛋白,Western-Blotting证明该蛋白为FGF21蛋白。经SDS-PAGE证明获得了可溶性的FGF21蛋白。该方法简化了纯化工序,提高了成品率,使大规模生产重组人成纤维细胞生长因子-21(rhFGF21)成为可能。
- 王会岩张耀方万晓珊解佳森肖业臣李校堃
- 关键词：分泌表达
- 人表皮生长因子融合蛋白的表达及纯化工艺的优化被引量：2
- 2010年
- 探讨了在大肠杆菌中生产小分子泛素样修饰蛋白与人表皮生长因子(SUMO-hEGF)的最佳表达及纯化条件。将重组表达载体pET3c-SUMO-hEGF转化到大肠杆菌BL21(AI)中,以阿拉伯糖为诱导剂,对诱导表达参数进行优化,并进一步通过离子交换层析,Ni-NTA亲和层析及分子筛层析等进行纯化分析。结果表明:SUMO-hEGF在BL21(AI)中的最佳诱导表达温度为37℃,诱导剂阿拉伯糖的最佳浓度为5.0g/L,最佳诱导表达时间为4h,表达量约为20.2%,Western blot分析证实,纯化后的蛋白是hEGF,为进一步开发hEGF基因工程药物奠定了基础。
- 张海淼刘孝菊田海山万晓珊邓林李校堃
- 关键词：人表皮生长因子阿拉伯糖纯化
- FGF21[Tyr^(20)]突变体的克隆、表达及纯化被引量：1
- 2010年
- 目的:将成纤维细胞生长因子21(FGF21)第20位氨基酸进行突变后,在大肠杆菌中表达,并进行纯化和生物活性检测。方法:以野生型的FGF21为模板,将FGF21第20位氨基酸Tyr进行PCR定点突变成Phe后与小分子泛素样修饰物(SUMO)融合,克隆至pET22b表达载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-SUMO-FGF21[Tyr20],克隆至BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blotting法进行鉴定,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,SUMO蛋白酶将SUMO切除,SephadexG-50除盐。结果:通过PCR定点突变,成功地将FGF21第20位氨基酸进行了突变,重组质粒pET22b-SUMO-FGF21[Tyr20]经PCR和双酶切鉴定后测序与预期结果相符。经SDS-PAGE电泳分析,蛋白为可溶性,纯化后成功获得FGF21[Tyr20]突变体蛋白,Western blotting分析显示FGF21[Tyr20]突变体蛋白与FGF21抗体有特异性反应。结论:成功构建并高效可溶性表达SUMO-FGF21[Tyr20]的突变体基因,获得FGF21[Tyr20]蛋白。
- 张耀方万晓珊赵宏鑫邵明龙杨苹孔祥鑫刘敏李校堃王会岩
- 关键词：原核表达纯化
- 人成纤维细胞生长因子21基因的克隆及在毕赤酵母中的表达被引量：1
- 2010年
- 目的:以毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115和SMD1168为宿主菌表达人源成纤维细胞生长因子21(hFGF21),为开发治疗糖尿病药物提供一定的实验基础。方法:根据毕赤酵母基因偏爱密码子和hFGF21氨基酸序列,设计多条寡核苷酸引物。利用融合PCR方法获得人工合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因,定向克隆到质粒pPIC9K中,电转化Pichia pastorisGS115和SMD1168。MD、MM平板筛选表型Mut+,YPD/G418平板进一步筛选高拷贝转化子。甲醇诱导表达,硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换方法纯化目的蛋白。结果:PCR扩增出约569bp的特异性片段,测序分析正确;诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:FGF21在宿主菌GS115中不表达,而在SMD1168表达上清中出现相对分子质量为20000的特异性条带,且与抗FGF21抗体产生特异性反应,阴性对照在该处无特异性带,证明hFGF21蛋白在SMD1168菌株中成功分泌表达。结论:成功克隆FGF21基因,并在Picha pastorisSMD1168中获得表达。
- 邵明龙赵宏鑫杨苹万晓珊孔祥鑫王会岩李校堃
- 关键词：毕赤酵母PPIC9K基因克隆
- 成纤维细胞生长因子-21[Arg^(59)]突变体基因的克隆及融合蛋白的表达与纯化被引量：2
- 2010年
- 目的:对野生型成纤维细胞生长因子-21(FGF21)进行突变改造及表达与纯化,为后续蛋白质体外偶联(Pull-down)实验及建立人源肝癌裸鼠模型奠定基础。方法:采用PCR定点突变方法,将FGF21cDNA第59位赖氨酸密码子突变为精氨酸密码子,所得的突变体片段与SUMO分子伴侣相连后插入表达载体pET20b,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。对表达产物进行Ni-NTA柱亲和层析、酶切和除盐等纯化分析。结果:PCR扩增出约546bp的特异性片段,测序分析表明已成功引入突变;所构建的pET20b-SUMO-FGF21[Arg59]重组阳性克隆经PCR与双酶切鉴定及测序分析,与预期结果一致;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约31500,且为可溶性;Western blotting分析证实:纯化后产物是成熟的FGF21[Arg59]突变体蛋白。结论:成功构建FGF21[Arg59]突变体基因,并经表达纯化得到成熟的FGF21[Arg59]突变体蛋白。
- 万晓珊赵宏鑫张耀方张海淼邵明龙王会岩李校堃
- 关键词：突变体纯化
