张耀方
- 作品数：7 被引量：22H指数：3
- 供职机构：吉林农业大学生命科学学院生物反应器与药物开发重点实验室更多>>
- 发文基金：吉林省科技厅科技发展计划项目吉林省科技发展计划基金博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人成纤维细胞生长因子-21分泌型表达及鉴定被引量：9
- 2009年
- 利用基因工程手段,将人成纤维细胞生长因子-21(hFGF21)与分泌信号肽相融合,构建得到能够分泌表达FGF21蛋白的表达载体。将该表达载体导入到Rosetta(blue)宿主细胞中,在分泌信号肽的引导下,在细胞周质中表达。经IPTG诱导表达可获得分子量为21 kD的蛋白,Western-Blotting证明该蛋白为FGF21蛋白。经SDS-PAGE证明获得了可溶性的FGF21蛋白。该方法简化了纯化工序,提高了成品率,使大规模生产重组人成纤维细胞生长因子-21(rhFGF21)成为可能。
- 王会岩张耀方万晓珊解佳森肖业臣李校堃
- 关键词：分泌表达
- FGF21生物学特性的研究进展被引量：7
- 2009年
- FGF21是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员,其氨基酸序列与其他亚家族成员之间有不同程度的同源性。FGF21在肝脏中特异性表达,能降低血糖、甘油三酯、胰高血糖素和果糖胺的浓度,改善胰岛β细胞的功能,因此有望成为治疗糖尿病、肥胖症及其他一些代谢综合症的药物。FGF21还有很多不同于其他FGFs家族的特点,如FGF21的信号传导需要βKlotho协同才能稳定结合FGFR;FGF21能通过血脑屏障等。另外,在斑马鱼体内还发现FGF21能促进造血功能。本文就FGF21的分子结构及其生物学特性的研究进展作一综述。
- 张耀方肖业臣王会岩
- 关键词：成纤维细胞生长因子21分子结构生物学特性
- 人成纤维细胞生长因子-21基因的克隆表达及蛋白的纯化被引量：7
- 2010年
- 目的:构建和表达人成纤维细胞生长因子-21(FGF21)的基因工程菌,为治疗2型糖尿病的新药开发提供实验数据。方法:通过PCR方法,以质粒pET20b-FGF21为模板扩增FGF21全长,将其与分子伴侣SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET20b连接后转化至BL21(Rosetta)宿主细胞中,通过IPTG诱导获得可溶性表达。将融合蛋白经Ni-NTA、分子筛等进行纯化,获得的蛋白纯度在95%以上。结果:经酶切和基因测序证实获得的FGF21基因序列与GenBank(登录号NM019113)报道的完全一致,构建的pET20b-SUMO-FGF21表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达FGF21蛋白,蛋白表达量在15%以上,经SDS-PAGE证实其相对分子质量为19401,与理论预期值相符。Western blotting分析该表达产物与人FGF21多克隆抗体具有特异性结合能力,经SUMO酶酶切后获得纯度大于95%以上的纯蛋白。结论:成功构建表达人FGF21融合蛋白的基因工程菌,经IPTG诱导、Ni-NTA、分子筛等进行纯化后获得了FGF21纯蛋白。
- 王会岩田海山赵宏鑫张耀方万晓姗邵明龙杨苹肖业臣李校堃
- 关键词：成纤维细胞生长因子21
- 重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化被引量：2
- 2009年
- 目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。
- 赵宏鑫邵明龙杨苹张耀方万晓姗孔祥鑫王会岩李校堃
- 关键词：SUMO纯化
- FGF21[Tyr^(20)]突变体的克隆、表达及纯化被引量：1
- 2010年
- 目的:将成纤维细胞生长因子21(FGF21)第20位氨基酸进行突变后,在大肠杆菌中表达,并进行纯化和生物活性检测。方法:以野生型的FGF21为模板,将FGF21第20位氨基酸Tyr进行PCR定点突变成Phe后与小分子泛素样修饰物(SUMO)融合,克隆至pET22b表达载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-SUMO-FGF21[Tyr20],克隆至BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blotting法进行鉴定,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,SUMO蛋白酶将SUMO切除,SephadexG-50除盐。结果:通过PCR定点突变,成功地将FGF21第20位氨基酸进行了突变,重组质粒pET22b-SUMO-FGF21[Tyr20]经PCR和双酶切鉴定后测序与预期结果相符。经SDS-PAGE电泳分析,蛋白为可溶性,纯化后成功获得FGF21[Tyr20]突变体蛋白,Western blotting分析显示FGF21[Tyr20]突变体蛋白与FGF21抗体有特异性反应。结论:成功构建并高效可溶性表达SUMO-FGF21[Tyr20]的突变体基因,获得FGF21[Tyr20]蛋白。
- 张耀方万晓珊赵宏鑫邵明龙杨苹孔祥鑫刘敏李校堃王会岩
- 关键词：原核表达纯化
- 角质细胞生长因子2基因(KGF2)的克隆及其对油菜的遗传转化
- 2010年
- 近年来,植物表达人源蛋白的研究逐渐增多。本研究以人角质细胞生长因子(KGF2)基因cDNA为基础,根据植物偏好密码子进行改造,并利用PCR方法合成KGF2基因全长cDNA。在此基础上构建了KGF2的植物油体系统表达载体p1390-YO-KGF2,并采用农杆菌介导法对甘蓝型油菜无菌苗的子叶进行转化。通过PCR、Southern杂交和Western blotting检测,证明外源基因KGF2已经转入油菜中并得到成功表达。
- 潘国庆张爽刘秀明李营张耀方李洪志李海燕李校堃
- 关键词：油菜转基因植株植物生物反应器角质细胞生长因子
- 成纤维细胞生长因子-21[Arg^(59)]突变体基因的克隆及融合蛋白的表达与纯化被引量：2
- 2010年
- 目的:对野生型成纤维细胞生长因子-21(FGF21)进行突变改造及表达与纯化,为后续蛋白质体外偶联(Pull-down)实验及建立人源肝癌裸鼠模型奠定基础。方法:采用PCR定点突变方法,将FGF21cDNA第59位赖氨酸密码子突变为精氨酸密码子,所得的突变体片段与SUMO分子伴侣相连后插入表达载体pET20b,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。对表达产物进行Ni-NTA柱亲和层析、酶切和除盐等纯化分析。结果:PCR扩增出约546bp的特异性片段,测序分析表明已成功引入突变;所构建的pET20b-SUMO-FGF21[Arg59]重组阳性克隆经PCR与双酶切鉴定及测序分析,与预期结果一致;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约31500,且为可溶性;Western blotting分析证实:纯化后产物是成熟的FGF21[Arg59]突变体蛋白。结论:成功构建FGF21[Arg59]突变体基因,并经表达纯化得到成熟的FGF21[Arg59]突变体蛋白。
- 万晓珊赵宏鑫张耀方张海淼邵明龙王会岩李校堃
- 关键词：突变体纯化
