丁爱军
- 作品数：9 被引量：10H指数：2
- 供职机构：扬州大学动物科学与技术学院更多>>
- 发文基金：江苏省高校自然科学研究项目国家自然科学基金江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 聚乙烯亚胺介导NIH-3T3细胞体外转染pEGFP-N1系统优化
- 2010年
- 目的优化聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导的细胞转染以提高目的基因在细胞中的表达强度。方法根据PEI/DNA不同的质量比(0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1)利用凝胶阻滞分析结合的情况;不同质量比PEI/DNA形成的复合物对NIH-3T3细胞的转染通过细胞表达强度获得最佳PEI/DNA质量比;比较实验组1(PEI/DNA质量比2:1)、实验组2(重复PEI/DNA质量比2:1)及实验组3(PEI/DNA质量比4:2)3种转染方案,探讨重复转染的方法是否提高细胞表达强度。结果①通过凝胶阻滞分析PEI/DNA能够稳定结合的质量比是1:1～10:1;②PEI/DNA复合物对NIH-3T3细胞进行转染,其荧光表达强度当PEI/DNA(质量比)≤2时随着PEI的增加而提高,当PEI/DNA(质量比)>2时,荧光表达强度反而降低;③采用重复转染的方法实验组2细胞荧光表达强度(24.08±0.28)%明显高于实验组1(8.97±4.02)%和实验组3(14.24±2.68)%(P<0.05)。结论在PEI/DNA(质量比)=2的条件下,PEI/DNA复合物转化NIH-3T3细胞的效果比较理想,重复转染可以提高细胞转染后荧光表达强度。
- 丁爱军任丽伟许峰秦玉蓉傅德智李碧春
- 关键词：聚乙烯亚胺细胞转染
- 鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达
- 2010年
- 为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。
- 田智泉杨海燕徐琪孙敏许峰任丽伟丁爱军秦玉蓉李碧春
- 关键词：毕赤酵母MX蛋白
- 体外重组神经氨酸酶的表达及其亚细胞定位研究
- 2011年
- 研究神经氨酸酶(NA)基因在体外培养NIH-3T3细胞中的表达定位。实验构建了真核表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA与pcDNA3.0-NA,采用聚乙烯亚胺介导基因转染法,分别转染NIH-3T3细胞,转染48 h后在荧光倒置显微镜下观察,并分别用RT-PCR与间接免疫荧光(IFA)进一步检测。结果表明:成功构建了EGFP-NA融合蛋白的表达载体;RT-PCR检测到EGFP-NA融合蛋白的表达;NIH-3T3细胞EGFP标记观察显示绿色荧光分布在胞质近胞膜,细胞核内无绿色荧光;间接免疫荧光鉴定显示,绿色荧光分布在细胞膜内外,表达的重组NA蛋白定位在细胞膜上。
- 任丽伟丁爱军傅德智李碧春
- 关键词：绿色荧光蛋白重组质粒
- 提高基因转染效率方法的研究被引量：6
- 2010年
- 本研究旨在提高基因转染的效率。试验使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导质粒pEGFP-N1转染NIH-3T3细胞,分为两组,分别进行一次转染和二次转染,于转染48h后在荧光倒置显微镜下观察。结果显示,部分细胞发出绿色荧光,二次转染组发绿色荧光的细胞明显多于一次转染组,且二次转染法可以明显提高基因的转染效率。
- 任丽伟丁爱军徐贵江李碧春
- 关键词：基因细胞转染效率
- 禽流感H5N1型神经氨酸酶在细胞中的表达
- 2010年
- 利用表达载体pIRES-NA研究H5N1型神经氨酸酶(neuramidinase,NA)基因在NIH-3T3细胞中表达,为今后转基因家禽的培育提供证据。通过构建重组表达载体转染细胞经G418筛选后,利用PCR方法检测NA基因在细胞基因组中整合,利用RT-PCR和Western Blotting的方法分别在RNA及蛋白质水平上检测NA基因在细胞中表达。结果表明细胞转染经筛选后,提取细胞基因组进行PCR,能扩增出NA基因片段,约1.4kb;同时RT-PCR能检测到NA基因mRNA,Western Blotting能检测到细胞表达约55ku NA蛋白,构建重组载体能整合到NIH-3T3细胞基因组中,NA基因能在细胞中表达。
- 丁爱军任丽伟傅德智李碧春
- 关键词：H5N1神经氨酸酶
- 鸡Mx-EGFP融合表达蛋白的细胞亚定位及其抗病毒活性研究被引量：1
- 2010年
- 为探索鸡Mx基因在细胞中表达的位置,以及Mx-EGFP融合表达时的抗病活性。构建了真核表达载体pcDNA3.0/EGFP-Mx,转染NIH-3T3细胞,通过报告基因EGFP的表达来定位Mx基因在细胞中表达的位置;通过抗VSV病毒试验来研究Mx-EGFP融合蛋白的抗病毒活性。结果显示,融合蛋白大部分在细胞质中表达,而细胞核中也有一部分表达;转染有质粒pcDNA3.0/EGFP-Mx的NIH-3T3细胞感染VSV病毒48h内,细胞没有发生病变;而只转染pcDNA3.0空载体的阴性对照组中,NIH-3T3细胞48h内已经发生病变。研究结果表明,Mx-EGFP融合蛋白主要分布在细胞质中,具有抗VSV病毒活性,能够延缓病毒感染病变时间。
- 田智泉倪黎纲吴晓伟任丽伟杨海燕孙敏丁爱军李碧春
- 关键词：MX基因VSV
- 两种载体重组神经氨酸酶基因及其在细胞中瞬时表达差异
- 2011年
- 2009年全球暴发的甲型H1N1流感对人和猪等一些动物健康构成了威胁,引起世界卫生组织（WHO）和世界各国密切关注。流感病毒表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）与流感传染和发病有关。NA是构成病毒囊膜纤突的一重要蛋白,可诱导机体产生NA抗体,
- 丁爱军傅德智吴信生高波李碧春
- 关键词：神经氨酸酶
- 禽流感病毒NA基因稀有密码子分析及其原核表达被引量：2
- 2009年
- 通过原核表达获取禽流感病毒(AIV)NA蛋白,为深入研究该蛋白的抗病性奠定基础。本试验以pMD19-T-NA为模板,PCR扩增NA基因完整开放阅读框(ORF),然后克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建表达质粒pET-NA;转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析检测;并利用稀有密码子在线分析软件对NA基因ORF进行分析。SDS-PAGE分析显示融合蛋白获得了表达,大小为65.4ku;稀有密码子统计表明,NA基因ORF中稀有密码子的比例高达13.4%,甚至还有多个稀有密码子串联成簇存在。重组质粒pET-NA构建正确,且在E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达出目的蛋白。
- 任丽伟丁爱军杨海燕田智泉孙敏徐贵江李碧春
- 关键词：基因大肠杆菌原核表达稀有密码子
- 鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析被引量：1
- 2009年
- 旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础。本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率。结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达。SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Mx在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础。
- 田智泉孙敏杨海燕任丽伟徐贵江丁爱军李碧春
- 关键词：MX基因克隆原核表达蛋白
