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EHEC0157：H7紧密黏附素及突变体与受体Tir的结合特性研究: 2012年; 目的表达纯化肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的紧密黏附素（intimin）及突变体intiminN916Y，并构建其转位紧密黏附素受体（translocatedint intin receptor，Tir）结合片段（intiminbinding domain，Tir-IBD），通过BIACore技术检测紧密黏附素及突变体intiminN916Y与Tit．IBD蛋白质相互作用特性的变化，探索特定氨基酸的突变对其黏附结合功能的影响。方法设计引物采用PCR法自EHEC0157：H7基因组扩增Tir—IBD的编码基因tir-~d，TA克隆后构建原核表达质粒pET-21a（＋）-tir—ibd，经测序鉴定后转化最coliBL21（DE3），IPTG诱导表达，PAGE检测。目的蛋白经Ni．NTA亲和纯化后，再用阴离子交换柱ResourceQ和分子筛柱Superdex200进行纯化。同时按包涵体复性后纯化的方案制备紧密黏附素及突变体intiminNgl6Y，将所得高纯度目的蛋白Tir-IBD适当稀释后耦联BIACore3000配套的NTA芯片，在25℃和37℃条件下分别以紧密黏附素及突变体intim．inN916Y作为流动相进行BIACore检测。结果EHEC0157：H7基因组扩增出了约270bp的目的片段；原核表达质粒pET-21a（＋）-tir-ibd经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化EcoliBL21（DE3）后IPTG诱导目的蛋白表达率约15％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（肘，）约10x103，破菌后电泳证实目的蛋白为可溶表达。Ni-NTA亲和纯化和阴离子交换纯化效果明显，高纯度的Tir-IBD蛋白耦联NTA芯片，在25℃和37℃条件下对紧密黏附素及突变体intiminN916Y与＇Fir．IBD相互作用的BIACore检测结果显示，intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性。结论EHEC0157：H7的紧密黏附素、突变体intiminN916Y及Tir-IBD经基因克隆后获得了较好的表达，纯化后获得高纯度的目的蛋白。在此基础上建立了蛋白相互作用的BIACore检测体系，证明intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并; 易勇肖敏罗萍樊峥贾莉萍魏平陈兴明李丹刘春雷高峰王贵华司少艳毛旭虎邹全明敬华; 关键词：蛋白质相互作用

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