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人核糖体DNA打靶载体介导mda-7基因对肝癌的体外基因治疗研究(英文)被引量：1: 2009年; 人核糖体DNA打靶载体pHr是一种由中南大学医学遗传学国家重点实验室开发构建的针对人类基因组的同源重组质粒载体.利用pHr构建了一种mda-7/GFP融合基因的人源基因表达载体pHr-CMG,并研究了其在肝癌细胞系Bel-7402中的作用.利用荧光显微镜、RT-PCR和Western blotting检测了mda-7/GFP融合基因的表达;利用细胞周期分析、MTT和Hoechst33258染色研究了其在细胞中的作用.结果显示,pHr-CMG载体能在Bel-7402细胞中有效表达MDA-7/GFP融合蛋白,进而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,推测其可能是由载体表达了mda-7基因引起细胞在G2/M期累积所导致的.同时,实验结果证实了人核糖体DNA打靶载体系统以及pHr-CMG表达载体的有效性,为其在进一步基因治疗研究中的应用提供了理论和实验基础.; 薛金锋刘雄昊何嫱薛志刚胡友金李卓杨俊林高庭潘乾龙志高邬玲仟夏昆梁德生夏家辉; 关键词：肝癌基因治疗

真核细胞中多重表达框mRNA的选择性翻译起始(英文)被引量：1: 2015年; 扫描模型和遗漏扫描模型是真核生物m RNA翻译起始的两种主要机制,但其仍存在某些例外情况,如对具有多顺反子结构的m RNA,选择性翻译起始的发生机制目前仍不清楚.本研究基于GFP蛋白开放表达框(ORF)构建了一系列重组表达载体,用以转录在移码翻译顺序及同一翻译顺序下,AUG起始密码子处于不同序列背景,以及间隔不同距离的多顺反子结构m RNA.通过转染人Bel-7402细胞系,研究了这些多顺反子结构m RNA的翻译起始模式.结果表明,在移码翻译顺序下,多顺反子m RNA可翻译出对应的不同蛋白质,而在同一翻译顺序下,GFP蛋白表达框中的多个AUG密码子,仅有首位起始密码子可发挥作用,提示核糖体在从首位起始密码子开始翻译的同时,可能会有部分核糖体继续向下扫描并识别下游的起始密码子,而这种选择性的翻译起始效率,主要取决于密码子所处的序列背景及间隔距离等因素.; 薛金锋刘雄昊李卓胡友金薛志刚谭杨高庭吴奔邬玲仟梁德生; 关键词：翻译起始核糖体

胎膜来源的间充质干细胞促进烧伤愈合的研究被引量：3: 2010年; 目的:研究胎膜来源的间充质干细胞在治疗SD大鼠Ⅲ度烧伤中的作用。方法:用胰酶消化法分离足月产胎膜细胞,加入Amino-MAXⅡ培养基进行培养。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD73、CD14、CD45。分别用浓度为3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml的明胶溶液包被脱细胞真皮(ADM),以5×106/ml的密度将细胞种植在包被和未包被的ADM表面,2小时后收集未贴附在ADM上的细胞,计算细胞种植效率。实验组:以7mg/ml的明胶包被ADM,以5×106/ml的密度种植第2～3代细胞,培养3～5天后,移植至SD大鼠Ⅲ度烧伤创面;对照组Ⅰ移植单纯的ADM,对照组Ⅱ未进行移植,术后定期观察创面大体情况,计算创面收缩率、表皮再生面积比例,第5周切取新生皮肤组织行HE染色。结果:胎膜分离的细胞以长梭形为主,表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29、CD73,极少表达造血细胞标志物CD14、CD45。不同浓度明胶溶液包被和未包被的ADM,其细胞种植效率均无明显区别(P>0.05);相比对照组,实验组移植物成活时间更长,创面再上皮化时间较早,创面收缩率较小,再生表皮面积亦较多(P<0.05);再生表皮更厚,有明显的表皮突,真皮层毛细血管丰富。结论:成功分离、培养了胎膜来源的间充质干细胞。胎膜来源间充质干细胞复合ADM可促进SD大鼠Ⅲ烧伤创面表皮再生,加速创伤愈合,抑制创面收缩。; 刘雄昊戴国胜冯劢赵凯吴奔杨俊林胡友金李卓薛金锋邬玲仟梁德生; 关键词：胎膜间充质干细胞脱细胞异体真皮烧伤治疗皮肤组织工程

增强型肿瘤特异性启动子介导CDTK治疗肝癌的体内外研究: 2015年; 目的:探讨运用增强子上调肿瘤特异性启动子h TERT转录活性后,调控自杀融合基因CDTK对人肝癌细胞系Bel-7402的体内外杀伤作用。方法:将CMV增强子、h TERT启动子及CDTK自杀融合基因克隆入核糖体基因区打靶载体p Hrn,构建p Hr-Ce Tp CDTK-GFP治疗载体并转染Bel-7402细胞,经RT-PCR、HPLC、MTT检测CDTK基因的表达和对肝癌细胞的体外杀伤效果。再将Bel-7402细胞接种到裸鼠皮下致瘤,以肿瘤杀伤载体p Hr-Ce Tp CDTK-GFP进行瘤内转染并检测其抑瘤效果,此外将转染后的细胞接种致瘤,检测其成瘤时间及肿瘤生长曲线等,从两方面检测其体内杀伤效果。结果:成功构建了肿瘤特异性治疗载体,体外转染肝癌细胞后,经RTPCR、HPLC证明CDTK基因能在肝癌中表达,且治疗载体在体外对肝癌细胞有明显毒性。动物实验结果发现裸鼠致瘤后治疗组血清中5-Fu浓度为7.694μg/ml,治疗组肿瘤体积与对照组相比减小6.5倍。而细胞转染治疗载体后致瘤,治疗组成瘤时间比对照组晚8天,且治疗组裸鼠的平均生存期较对照组延长16天。结论:p Hr-Ce Tp CDTK-GFP载体能在体内外高效靶向杀伤肝癌细胞,为肝癌基因治疗提供了一种新的途径。; 薛金锋薛志刚陈毅瑶李卓尹彪邬玲仟梁德生; 关键词：肝癌基因治疗

用原核增强子提高hTERT启动子介导的基因表达被引量：8: 2006年; 目的：探讨原核增强子能否提高hTERT启动子的转录活性及对其肿瘤特异性的影响。方法：将增强子SV40、CMV分别或组合构建一系列GFP和荧光素酶报告基因载体，转染人肝癌、鼻咽癌、宫颈癌、结直肠癌细胞、成纤维肉瘤和正常成纤维细胞，流式细胞仪计数和双荧光酶分析系统检测基因的表达效率。结果：在正常成纤维细胞中这些载体均不能有效表达；而在肿瘤细胞中hTERT启动子能介导基因表达但效率不高，增强子能使基因表达增强3～26倍，特别是单独CMV增强子和SV40-CMV双增强子使荧光素酶表达提高20-26倍，是常用的CMV增强子／启动子的2～7倍；完整CMV增强子／启动子对hTERT启动子的活性影响因不同细胞而异。结论：增强子能显著增强hTERT启动子的转录活性并对其肿瘤特异性没有影响，CMV增强子或SV40-CMV双增强子／hTERT启动子是高效特异的通用调控元件，用于靶向性肿瘤基因治疗具有巨大潜力。; 王丽娜李卓薛志刚薛金锋胡友金周银李剑潘乾夏昆梁德生夏家辉; 关键词：端粒基因表达

特异性核糖体基因区打靶载体介导CDUPRT治疗肝癌的体内外研究被引量：1: 2006年; 核糖体基因区打靶载体pHrn是本室构建的人源基因载体之一，为探讨其在肝癌基因治疗的作用，本研究构建了pHr—CeTpCDUPRT／GFP质粒载体并进行了肝癌的体内外治疗实验研究．该质粒载体以pHrn载体为骨架，CMV＋hTERT启动子作为转录调控元件，CDUPRT／GFP自杀融合基因为目的基因．体外转染肝癌细胞BEL7402后，流式细胞仪检测转染效率为30％～50％；RT—PCR和Western blotting结果表明，有CDUPRT表达；HPLC检测5-FC可转化为5-Fu，给药后12 h 5-Fu浓度达60．15μg／mL；四唑盐（Methylthiazolyl tetrazolium，MTT）分析结果显示，200～800μg／mL5-FC使BEL7402的平均存活率为60％～35％．同时，对裸鼠肝癌模型进行瘤内转染，结果显示，当持续注射质粒和前体药物治疗时，裸鼠肿瘤生长明显被抑制，甚至体积稍有缩小；RT—PCR检测结果表明，瘤内有CDUPRT表达；HPLC检测裸鼠血清中的5-FU浓度为7．694μg／mL；肿瘤组织病理切片显示，大量肿瘤细胞坏死．这些结果为实际应用此载体进行肝癌基因治疗提供了重要的实验依据．; 王丽娜薛志刚李卓薛金锋刘雄昊潘乾龙志高蔡芳邬玲阡戴和平夏昆梁德生夏家辉; 关键词：增强子 HTERT启动子自杀基因肝癌基因治疗

真核生物多顺反子mRNA翻译起始研究: 真核生物与原核生物一个很重要的区别就在于真核生物mRNA是单顺反子结构，而原核生物mRNA是多顺反子结构。自从Kozak等提出了扫描机制模型后，这种起始方式就成为了真核生物mRNA翻译过程中最重要的机制之一。是否存在其他...; 薛金锋; 关键词：真核生物翻译过程 GFP基因 PCR方法; 文献传递

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