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转基因猪细胞中CMV启动子区域甲基化的研究: 2015年; 为研究转基因猪外源基因表达与启动子区域甲基化的关系,利用流式细胞仪检测体外传代至第5、10和15代的转基因猪成纤维细胞中EGFP荧光强度的变化情况;采用亚硫酸盐测序的方法对这3代细胞CMV IE启动子区域30个Cp G岛的甲基化程度进行测定。结果显示细胞从第5代培养到第10代时荧光变弱,但是当继续培养到15代时EGFP荧光又渐渐变强,但EGFP阳性细胞的比例没有发生变化,均为100%。第5、10、15代细胞启动子区域的Cp G岛甲基化阳性率分别为3.64%±1.25、2.97%±1.03和1.65%±0.74,统计结果表明3代细胞间的甲基化阳性率差异不显著(P>0.05)。表明转基猪成纤维细胞中CMV启动子区域的甲基化程度随着体外培养时间的变化不明显,与EGFP的表达水平变化无明显相关。; 任广彩张英丛佩清陈瑶生何祖勇; 关键词：甲基化启动子 CPG岛转基因猪

利用ZFN敲除转基因猪细胞中多拷贝EGFP基因: 2014年; 锌指核酸酶（zinc finger nuclease,ZFN）是由特异性识别DNA的锌指结构域和Fok I切割结构域组成,能够在基因组特定位点上切割DNA,引起DNA双链断裂（double-strand break,DSB）.通过DSB修复机制,可以使基因修饰的效率比传统方法提高102~104倍.目前,利用ZFN对动物内源基因进行敲除的研究较多,但对转基因动物中外源多拷贝基因进行敲除的报道较少.本研究首先利用荧光定量PCR法对本实验室培育的两头转基因猪中增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的拷贝数进行鉴定,发现其拷贝数分别为11.95和17.36拷贝;然后将靶向EGFP的一对ZFN转染进拷贝数为17.36的EGFP转基因猪的成纤维细胞中,并通过流式和CEL-1酶切方法检测敲除效率.结果表明,转染400 ng、800 ng和1 200 ng ZFN的切割效率分别为0.97%、1.39%和1.76%,可见随着转染ZFN剂量的增加,ZFN的切割效率逐渐提高.但是,不发绿色荧光的细胞比例却没有明显提高,因此认为,ZFN敲除转基因动物中多拷贝基因的效率还是比较低.; 任广彩张英丛佩清陈瑶生何祖勇; 关键词：锌指核酸酶增强型绿色荧光蛋白转基因猪

利用锌指核酸酶对猪基因组进行定向遗传修饰: 2013年; 人工锌指核酸(zinc finger nucleases,ZFN)在植物和动物细胞中可以有效提高DNA修饰的效率和特异性使它很快就成为当前的一个研究热点。ZFN可使DNA双链断裂,然后依靠细胞中复杂的DNA修复机制修饰特定的基因。本文主要介绍ZFN在生产转基因猪研究中的应用及其未来的应用前景。目前采用传统的基因打靶和体细胞核移植的方法,科学家们已经获得了一批基因敲除猪。然而采用传统的基因打靶技术对哺乳动物体细胞进行遗传修效率较低,而且位点特异性和外源DNA整合效率都难以控制。ZFN能够结合到DNA特定位点上,并产生切割作用,使基因打靶的效率提高了几个数量级。本文将详细介绍目前应用ZFN技术获得基因敲除猪模型的几项研究,以及应用ZFN技术加快生产可用于农业生产和生物医药研究的转基因猪。文中还将讨论ZFN在猪的基因组遗传修饰中的安全性和有效性,以及ZFN技术在生猪产业中的创新性应用。; 张英何祖勇陈清森陈瑶生; 关键词：遗传修饰锌指核酸酶

利用锌指核酸酶对猪基因组进行定向遗传修饰(续完): 2013年; 4利用ZFN修饰猪的基因组早期通过ZFN获得遗传修饰动物的研究开始于将其注射到非洲爪蟾（Xenopus laevis）的卵母细胞中（Bibikova等,2001）。虽然最终没有得到活着的基因敲除蟾蜍,但是这个研究证明了ZFN在活体内具有活性,以及可以通过同源重组介导基因组修饰。; 张英何祖勇陈清森Whyte J.J.Prather R.S.; 关键词：遗传修饰猪基因组核酸酶锌指非洲爪蟾

哺乳动物非经典分泌信号肽介导重组EGFP蛋白向毕赤酵母细胞壁转运: 2016年; 为探索哺乳动物非经典分泌信号肽在毕赤酵母表达系统中引导重组蛋白分泌的作用,本研究将一段来源于小鼠同源异型框蛋白(En2)的分泌信号序列(SS)融合至EGFP蛋白的N端,在毕赤酵母中表达。实验结果显示SS信号肽能通过一种不同于经典的内质网-高尔基体分泌通路的方式将EGFP蛋白分泌至细胞膜表面,与α交配因子前导肽相比,显著降低了细胞的内质网压力。本研究提示哺乳动物非经典分泌信号肽可作为递送重组蛋白至酵母膜表面的一项工具。; 覃玉凤陈瑶生刘志国张英刘海龙何祖勇; 关键词：毕赤酵母

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张英