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孙亭亭: 作品数：12 被引量：6H指数：1; 供职机构：云南农业大学动物科学技术学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金云南省应用基础研究基金国家高技术研究发展计划更多>>; 相关领域：农业科学生物学更多>>

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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定: 2015年; 本试验旨在构建能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的重组质粒。用疑似患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪的脾脏、肺脏病料提取RNA,根据PRRSVORF5基因设计1对引物,进行RT-PCR扩增,将ORF5目的基因克隆到pMD19-T载体中,得到pMD19-ORF5重组菌。根据测序结果和表达载体特点,设计1对带有NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,扩增目的片段(dORF5),将其分别与pProEXHTb载体、pNZ8149载体连接,得到HTb-dORF5/DE3和pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌,分别用IPTG和Nisin诱导,再进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,HTb-dORF5/DE3重组菌在1.5mmol/L IPTG诱导时表达量最高,通过SDSPAGE和Western blotting分析,在约22ku处有特异性条带,且具有反应原性;pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌在20ng/mL Nisin诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约19ku处有特异性条带,间接免疫荧光试验有特异性绿色荧光。本研究成功构建重组质粒HTb-dORF5和pNZ8149-dORF5并获得表达,这为进一步研制预防PRRS疫苗奠定坚实基础。; 周玉照马志亮孙亭亭杨洁张小苗柴俊张娜娜张以芳; 关键词：ORF5基因大肠杆菌乳酸乳球菌

红色原鸡外周血单个核细胞IFN-γ的诱导表达及其荧光定量PCR检测: 2014年; 为建立检测红色原鸡外周血单个核细胞(PBMC)中干扰素γ(IFN-γ)mRNA表达水平的方法,通过优化刀豆蛋白A(Con A)诱导PBMC表达IFN-γ的条件,采用RT-PCR方法以3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参扩增IFN-γ基因,插入克隆载体pMD18-T分别构建重组质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH,以其作为标准品采用SYBR Green I染料法建立荧光定量PCR检测方法,并将该方法应用于34只红色原鸡PBMC IFN-γ表达量的检测。结果发现,PBMC在20μg/mL Con A刺激培养12-25 h时IFN-γ处于高表达水平;标准品质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH分别在拷贝数6.72×102-6.72×109、3.94×102-3.94×109范围内与其对应的Ct值呈现良好的线性关系(R2>0.99),扩增产物的熔解曲线均只有特异的单峰,表明所用引物特异性强。在优化Con A诱导红色原鸡PBMC表达IFN-γ条件的基础上,建立了可用于定量检测红色原鸡PBMC IFN-γmRNA表达水平的荧光定量PCR方法。; 孙亭亭冀斌马志亮胡文丽鲁琼芬张雄伟陈培富; 关键词：CON 荧光定量PCR 外周血单个核细胞

奶牛结核病候选基因CARD15基因及功能突变检测方法: 本发明属于分子生物学动物疾病诊断技术领域，具体涉及一种奶牛结核病候选基因CARD15基因及其功能突变检测方法。本发明提供的奶牛结核病候选基因CARD15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的奶牛结核...; 张以芳柳桐史宪伟王生奎柴俊马志亮孙亭亭秦波王有涛; 文献传递

红色原鸡IFN-γ基因的克隆及原核表达: 2014年; 应用能够选择性克隆同源双链DNA的方法(PCR+1)从刀豆蛋白A诱导的红色原鸡外周血淋巴细胞中扩增γ干扰素(IFN-γ)编码区基因,双酶切后连接至克隆载体pUC18。以阳性质粒为模板扩增IFN-γ成熟肽基因,连接至原核表达载体pProEXTMHTb,筛选出阳性重组质粒HTb-IFN-γ;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,采用PCR+1方法扩增得到560bp IFN-γ编码区基因,成功连接至克隆载体并以此为模板扩增出473bp成熟肽基因,构建的重组表达质粒HTb-IFN-γ在BL21(DE3)中经IPTG诱导表达出分子质量约为21ku的IFN-γ。Western blot分析显示,表达的IFN-γ能够与抗IFN-γ多克隆抗体特异性反应,具有良好的免疫活性。; 孙亭亭马志亮冀斌胡文丽陈培富; 关键词：IFN-Γ 原核表达

荧光定量PCR评价猪繁殖与呼吸障碍综合征活疫苗中病毒含量方法的建立及初步应用: 为了建立快速、敏感、特异的评价猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)活疫苗中病毒含量的方法,根据GeneBank中PRRSV基因序列设计合成了标准品引物和定量引物,RT-PCR扩增PRRSV基因片段并连接到pMD18-T载体...; 马志亮孙亭亭杨洁范斌刘旭川张以芳; 关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征活疫苗病毒含量荧光定量PCR

一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法: 本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法, 属疫苗质量监测技术领域。本发明方法包括特异性引物及Taqman荧光探针的设计、RNA提取、cDNA制备、标准质粒构建、Taqman荧光定量PCR检测...; 张以芳马志亮范斌柴俊孙亭亭邹丰才刘岳柳桐杨洁; 文献传递

细胞分化的甲基化调控及其分子机理被引量：1: 2014年; 长期以来,对细胞分化过程的研究,尤其是对干细胞及其谱系的功能差异分析,主要集中在基因的转录水平调控。然而,越来越多的研究发现,DNA的甲基化、染色质重塑、基因组印记、染色体失活、非编码RNA作用等表观遗传学机制对哺乳动物发育、胚胎细胞分化及癌细胞增殖过程发挥着重要的作用。其中以DNA甲基化这种形式最为常见。作者就DNA甲基化对影响转录、分子调控、神经元发育、遗传等方面的最新研究成果进行综述。; 冀斌孙亭亭陈培富; 关键词：表观遗传甲基化分子机制细胞分化

干扰素诱导表达跨膜蛋白基因家族的功能研究: 2014年; 干扰素在调控哺乳动物的固有性免疫系统抗病毒感染早期起着关键的作用,通过干扰素表达量和调控方改变来精密协调固有性免疫系统发现感染病毒并加强对早期感染病毒的抵抗力。固有性免疫反应中的干扰素诱导跨膜蛋白家族被认为通过调节机体细胞的增殖、信息传导复合物的形成来限制病毒感染。大多数病毒病可能取决于病毒和宿主的干扰素系统的相互作用。干扰素诱导表达的跨膜蛋白3(IFITM3)基因在机体大多数组织中转录并且被固有性免疫反应产生的干扰素强烈诱导,被认为在细胞增殖,信号传递和限制病毒感染过程中起着关键作用。; 王凯孙亭亭高杰锋史洪亮; 关键词：固有免疫干扰素病毒感染

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗中病毒含量荧光定量PCR测定方法的建立及初步应用被引量：4: 2014年; 为建立快速、敏感、特异的评价猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）活疫苗中病毒含量的方法，根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因序列设计合成了标准品引物和定量引物，RT—PCR扩增PRRSV基因片段并连接到pMD19-T载体上，构建标准品质粒pMD19-TPRRSV。采用SYBRGreenI染料法进行荧光定量PCR检测，分析标准曲线并进行特异性、稳定性、重复性试验。结果显示，该方法检测病毒含量为7．43×10^0～7．43×10^8拷贝／μL，标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值之间相关系数高（R2=0．9989），引物特异性强。应用该方法对6个厂家PRRS活疫苗中的病毒含量进行测定，发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量差异较大，最高差异可达47．9倍。本试验建立的检测PRRS活疫苗病毒含量的荧光定量PCR方法可用于疫苗生产过程中及免疫动物前疫苗质量的评价。; 马志亮孙亭亭杨洁范斌刘旭川张以芳; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征活疫苗荧光定量PCR

嗜水气单胞菌的分离与16S rDNA鉴定被引量：1: 2014年; [目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌,并构建系统发育分析。[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养,并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析。[结果]分离培养到1株细菌,命名为Ah1305。经表型鉴定、生化试验及16S rDNA系统发育分析,鉴定为嗜水气单胞菌。[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考。; 柳桐王生奎孙亭亭马志亮秦波张以芳信爱国; 关键词：嗜水气单胞菌 RDNA

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