刘冯欢
- 作品数：6 被引量：9H指数：2
- 供职机构：四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金四川省卫生厅科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 甲型流感病毒核蛋白的表达与鉴定及其B细胞表位的预测
- 2013年
- 目的构建甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)的原核表达载体,诱导NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定;预测人NP蛋白的B细胞抗原表位。方法以pcDNA3.1(+)/NP为模板,利用PCR方法扩增目的片段NP,再将此片段插入原核表达载体pET-32a(+),并进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的质粒转入表达菌Rosetta-gami(2)中,用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测表达产物。按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplns-Schulz方法预测蛋白骨架区的柔韧性;用Kyte-Doolittle方法预测其亲水性,Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数。结果成功构建了流感病毒核蛋白(NP)的原核表达载体,经SDS-PAGE检测NP蛋白得到了表达,Western Blot证明表达的重组蛋白具有免疫活性。在蛋白质第6～11、79～91、241～248和319～326区段附近很可能为B细胞表位优势区域。结论流感病毒核蛋白的表达及B细胞表位的预测为流感病毒的快速诊断试剂的研发工作提供了基础。
- 李莎刘冯欢李明远李燕张菁杨靖丁娜娜李婉宜王保宁
- 关键词：流感病毒核蛋白B细胞表位
- 小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用被引量：2
- 2010年
- 目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。
- 张强李明远丰锋巩天祥李婉宜刘冯欢冯艳邝玉王保宁
- 关键词：Β防御素甲型流感病毒融合基因重叠延伸PCR免疫荧光
- 小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究
- 2010年
- 目的构建小鼠β-防御素6(mBD6)与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3.1(+),构建成pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融合基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。
- 冯伟李婉宜李明远张强巩天祥刘冯欢罗俊邝玉王保宁蒋忠华
- 关键词：甲型流感病毒
- 抗感颗粒抗甲型流感病毒的实验观察被引量：5
- 2010年
- 目的 观察抗感颗粒在鸡胚和BALB/c小鼠体内抗甲型流感病毒的作用.方法 （1）鸡胚实验：将甲型流感病毒鼠肺适应株FM1接种9日龄鸡胚,再将不同剂量的抗感颗粒注入鸡胚,以血凝效价为指标,观察抗感颗粒对流感病毒的作用,设立流感病毒对照组和利巴韦林片对照组,每组6个鸡胚.（2）小鼠实验：将BALB/c小鼠随机分为病毒感染模型组、正常对照组、利巴韦林片组及抗感颗粒低、中、高剂量组,每组20只小鼠.用流感病毒感染小鼠后灌胃给药,以实验小鼠的生存情况、死亡保护率及延长生命率等指标观察抗感颗粒的抗流感病毒作用.结果 在鸡胚实验中,抗感颗粒高、中剂量组均能抑制流感病毒复制并达到显效结果,病毒血凝效价比流感病毒对照组分别低了5个、3个稀释度.在小鼠实验中,抗感颗粒各剂量组均能减轻感染小鼠的发病症状,减少小鼠死亡,死亡保护率为35.0%～55.0%;生存时间延长,延长生命率为73.0%～88.9%、最低有效剂量为3.00g/kg.结论 抗感颗粒对甲型H1N1流感病毒的增殖有抑制作用,对流感病毒感染引起的小鼠死亡有保护作用.
- 刘冯欢李明远罗俊李婉宜王保宁杨远邝玉左斌马秀英蒋忠华
- 关键词：流感病毒A型抗感颗粒H1N1
- 甲型流感病毒核蛋白的表达与鉴定及其B细胞表位的预测
- 目的:构建甲型流感病毒核蛋白（nucleoprotein,NP）的原核表达表达载体,诱导NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定;预测人NP蛋白的B细胞抗原表位。方法:以pcDNA3.1（+）/NP为模板,利用PCR方法扩增...
- 刘冯欢张菁王欢左斌李婉宜王保宁李明远李燕
- 文献传递
- 小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究被引量：2
- 2009年
- 目的构建小鼠β防御素3(mouseβdefensin3,mBD3)基因的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3.1(+)/mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a(+)原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami(2),用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和Western Blot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠β防御素3(f mBD3)的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌无作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。
- 江滟王保宁杨晓芳李婉宜刘冯欢蒋忠华李明远
- 关键词：原核表达融合蛋白抗菌作用
