王双利
- 作品数：14 被引量：56H指数：4
- 供职机构：暨南大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划广东省科技攻关计划广东省医学科学技术研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 改进酶消化法培养SD大鼠成骨细胞及其鉴定被引量：22
- 2008年
- 目的:改进SD大鼠成骨细胞的体外分离、培养方法并进行功能鉴定。方法:将新生SD大鼠处死,无菌条件下取出颅骨,剔净骨膜后剪成1mm×1mm×1mm大小组织块。组织块经0.25%胰蛋白酶消化20min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化。观察细胞形态学,选用碱性磷酸酶Gomori钙钴法染色,钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行鉴定。结果:培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,在体外培养时可维持其在体内的功能,即合成碱性磷酸酶、形成矿化结节,Ⅰ型胶原染色阳性。结论:用改进后的酶消化法分离、培养SD大鼠成骨细胞,更能减少胰蛋白酶在消化过程中对细胞造成的损伤,所获成骨细胞量多、纯度高,操作简易可行,可作为骨组织工程种子细胞常规的培养方法。
- 王双利查振刚刘宁杨淑野吴昊姚平张嘉晴
- 关键词：成骨细胞
- 骨髓间充质干细胞与仿生纳米壳聚糖-胶原复合物修复大鼠胫骨缺损的实验研究被引量：4
- 2008年
- 目的:4周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞离体培养后与仿生纳米壳聚糖-胶原(nano chitosan-so-dium collagen,nano-CS-COL)形成复合支架,植入SD大鼠胫骨缺损处,比较修复节段性胫骨缺损的效果,初步探讨治疗骨缺损的组织工程学方法。方法:4周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)离体培养、纯化、鉴定、扩增后在等同于细胞培养的条件下与nano-CS-COL复合培养,制成MSCs/nano-CS-COL复合物并经电镜扫描证实复合物有细胞生长。制成同种异体SD大鼠胫骨干5mm节段性动物模型,MSCs/nano-CS-COL复合物通过手术移植入动物模型胫骨缺损处,通过大体观察、X线放射学、组织学对比实验组与对照组、空白组骨缺损修复情况。结果:术后6、12周实验组与实验对照组放射学检查评价新骨生成有显著差异(P<0.05)。术后组织学检查新骨生成速度、生成量均有显著差异。实验组标本与正常组基本一致。空白对照组不能自行修复骨缺损,最后缺损由纤维组织充填。结论:BMSCs是骨组织工程中适宜的种子细胞。Nano-CS-COL复合支架能够与SD大鼠骨髓间充质干细胞体外复合培养,移植入异体SD大鼠后未见明显免疫排斥反应,是可以选择的细胞载体。MSCs/nano-CS-COL复合物植入修复鼠胫骨缺损能够加速新骨形成,修复效果明显优于单纯CS植入组。
- 刘宁杨淑野王双利刘宏伟屠美吴昊张利黄春华查振刚
- 关键词：骨髓间充质干细胞骨缺损
- PLGA-Ⅱ型胶原复合rhBMP-2/bFGF修复兔膝关节软骨的缺损被引量：8
- 2009年
- 目的:探讨经Ⅱ型胶原涂层改性后的聚丙交酯-乙交酯(PLGA)材料(PLGA-Ⅱ型胶原)用作生长因子重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)和碱性成纤维生长因子(bFGF)载体来修复兔膝关节软骨缺损的可行性和有效性。初步探讨生长因子rhBMP-2和bFGF之间在修复兔膝关节软骨缺损中的协同作用机制。方法:将45只成年新西兰兔随机分成A^E 5组,每组9只,用在兔右侧膝关节内侧髁钻孔的方式建立软骨缺损模型,A组植入PLGA-Ⅱ型胶原/rhBMP-2+bFGF复合物,B组植入PLGA-Ⅱ型胶原/rhBMP-2复合物,C组植入PLGA-Ⅱ型胶原/bFGF复合物,D组植入单纯PLGA-Ⅱ型胶原支架材料,E组未植入任何材料。将A、B、C组统称为实验组,D、E组统称为对照组。分别于术后4周,8周,12周处死动物,取材进行大体、组织学观察。结果:实验组的复合材料对软骨缺损的修复都有不同程度的促进作用,其中A组的效果最佳,对照组的软骨缺损的修复不明显,实验组总评分与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。结论:3种带生长因子的复合体材料对兔软骨缺损的修复都有明显的促进作用。PLGA-Ⅱ型胶原复合物可用作生长因子rhBMP-2和bFGF的载体材料。生长因子rhBMP-2、bFGF对软骨缺损的修复均有促进作用,并且在剂量比为0.5 mg∶50 ng时存在着协同作用。
- 束志勇查振刚汪炬黄春华刘宁吴昊王双利
- 关键词：聚丙交酯-乙交酯重组人骨形态发生蛋白关节软骨缺损
- 纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性[英文]被引量：4
- 2008年
- 背景：新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似,其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长,并显示良好的相容性？目的：评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性。设计：单一样本观察。单位：暨南大学附属第一医院骨科。材料：实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成。选取10只4周龄雌性SD大鼠,SPF级,体质量200g,由广东省实验动物中心提供（许可证号为SCXK（粤）2003-0002）。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供。方法：①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测。②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架。③取生长良好的P3代,与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养,以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性。主要观察指标：①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定。②纳米材料及细胞复合2,4,8d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况。③细胞对材料黏附率的测定。④细胞与材料复合5d检测细胞周期及活力。结果：①细胞表面抗原标志检测结果：CD29表达为90.86%,CD106表达为73.38%,CD44表达为82.61%,CD34表达为0.76%,CD45表达为0.60%。②细胞与材料相容情况：扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构,材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔,彼此相互交通。应用质量法测得的孔隙率为85%~90%,孔径为50~300μm,平均150μm。骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2d,细胞呈球形散在分布;4d后细胞呈梭形,延展爬行且有伪足与材料表�
- 杨淑野查振刚王双利刘宏伟屠美吴昊刘宁张利黄春华
- 关键词：骨髓间充质干细胞
- 优化酶消化法体外培养及鉴定SD大鼠的成骨细胞(英文)被引量：3
- 2008年
- 背景:体外成骨细胞的培养技术已经有了很大的发展。但是,在培养过程中,如果胰蛋白酶的消化时间过长,成骨细胞膜便易受到损伤;同时,传统的培养方法存在所获得的成骨细胞数量少、纯度不高等不足。因此,有必要探求一种新的体外培养成骨细胞的方法。目的:优化成骨细胞在体外条件下的培养方法并对其进行鉴定。设计:观察性实验。单位:暨南大学附属第一医院骨科。材料:实验于2007-03/05在暨南大学附属第一医院骨科完成。选用出生24h的SD大鼠8只,由南方医科大学实验动物中心提供,雌雄不拘。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验用Ⅱ型胶原酶由美国Sigma公司分装,胰蛋白酶为Sigma公司产品,碱性磷酸酶试剂盒由南京建成生物制品公司生产,SABC-1021试剂盒由武汉博士德公司进口分装。方法:挑选24h之内的新生SD乳鼠麻醉后处死,无菌条件下取出颅骨,剔除附着的结缔组织及骨膜,D-Hank’s液冲洗3次。不强调对颅骨内、外膜,骨缝连接处等附着的结缔组织及颅顶的透明软骨结节等进行反复多次的剔除,避免操作时间过长影响细胞的存活率。结合0.1%Ⅱ型胶原酶来消化SD乳鼠颅骨,减少并严格控制胰蛋白酶的消化时间。组织块经0.25%胰蛋白酶消化20min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化。主要观察指标:应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜观察成骨细胞形态特点。采用碱性磷酸酶Gomori钙钴法染色、钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色方法进行鉴定成骨细胞生物学特性。结果:原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,细胞呈多角形或梭形,具有多个突起可互相连接,细胞核较幼稚,细胞器丰富,具有典型的成骨细胞形态特征。体外培养的成骨细胞可分泌碱�
- 王双利刘宁杨淑野吴昊查振刚
- 关键词：成骨细胞SD大鼠
- 骨髓间质干细胞与Ⅱ型胶原修饰的PLGA黏附性的观察
- 2007年
- [目的]优化骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养技术,改良生物材料聚乙醇酸-乳酸共聚物(poly lactide-co glycolide,PLGA)的细胞黏附性,观察BMSCs与Ⅱ型胶原修饰的PL-GA的黏附性。[方法]密度梯度离心法分离BMSCs,流式细胞分析法(FACS)对细胞表面抗原、细胞活力、细胞周期进行检测,相差显微镜观察细胞形态。相分离法制做PLGA,Ⅱ型胶原进行表面修饰,取第三代干细胞与PLGA附和,扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。[结果]BMSCs可在体外分离扩增,表达CD29、CD44和CD106,不表达CD34和CD45,细胞活力为88.96%,G0-G1细胞占90.32%。细胞形态为长梭形,Ⅱ型胶原表面修饰的PLGA平均孔径为100μm,与BMSCs有较好的黏附性。[结论]BMSCs可在体外长期、稳定培养,是理想的组织工程种子细胞。Ⅱ型胶原表面修饰的PLGA与干细胞有较好的黏附性,可用来做组织工程生物材料。
- 张利查振刚周长忍姚平吴昊林宏生杨淑野王双利
- 关键词：骨髓间质干细胞PLGA
- 骨髓间充质干细胞与复合Ⅰ型胶原和骨形态发生蛋白2的聚乳酸乙醇酸构建组织工程骨被引量：1
- 2008年
- 目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSC）体外分离培养后种植到复合Ⅰ型胶原和重组人类骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）的聚乳酸乙醇酸（PLGA）生物支架上，构建组织工程骨的可行性。方法密度梯度离心法提取分离BMSC，倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞分析法对细胞表面抗原进行鉴定。相分离法制备多孔三维PLGA生物支架，支架材料上复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2，扫描电镜观察其超微结构。将第3代的BMSC接种于复合支架上，扫描电镜观察材料的细胞黏附性，将培养6h后的细胞-支架复合体植入sD大鼠肌袋内，于2个月后取材进行HE染色，观察其构建组织工程骨的情况。结果BMSC可在体外分离扩增，表达CD29、CD44，不表达CD34和CIM5。制备的PLGA支架孔隙率为90％，平均孔径为100μm，与BMSC有较好的黏附性。2个月后动物体内细胞-支架复合体的大体观察和HE染色显示，BMSC种植到复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2的PLGA生物支架上可构建骨组织。结论BMSC可在体外长期、稳定培养，是理想的组织工程种子细胞。PLGA与干细胞有较好的黏附性，可用来做组织工程生物材料。BMSC种植到复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2的PLGA生物支架上后，在动物体内可构建组织工程骨。
- 查振刚李劼若周长忍姚平吴昊刘宁黄春华杨淑野王双利
- 关键词：骨髓间质干细胞聚乳酸乙醇酸组织工程骨
- 股骨近端Z形短缩截骨全髋置换术治疗成人CroweⅣ型发育性髋关节脱位被引量：1
- 2008年
- 目的探讨股骨近端Z形短缩截骨全髋置换术治疗CroweⅣ型成人髋关节发育不良的手术方法和临床疗效。方法2000年7月至2006年2月，对13例CroweⅣ型成人发育性髋关节脱位继发骨关节炎患者行全髋关节置换术，同时采用股骨近端Z形短缩截骨。回顾性分析13例患者的临床资料，其中左髋9例，右髋4例。术前Harris评分36．9分。结果所有患者均获得随访，随访时间4-55个月，平均32个月。Harris评分术后增加至84．1分。患者均能白行下地行走，步态明显改善，髋关节功能良好。结论股骨近端Z形短缩截骨及全髋关节置换术是治疗CroweⅣ型成人髋关节发育不良继发骨关节炎的有效方法，但手术难度大。其后期疗效有待进一步随访观察。
- 刘宁查振刚姚平倪诚林宏生王国普李志忠潘锐吴昊王双利
- 关键词：髋脱位短缩
- 成骨细胞诱导骨髓基质细胞体外成骨的初步研究被引量：5
- 2009年
- 目的:探讨在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞(Osteoblast,OB)与骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)混合培养时,成骨细胞提供的成骨微环境能否在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,并复合支架形成成熟的骨组织。研究成骨细胞诱导BMSCs有效成骨的最小比值(指成骨细胞与骨髓基质干细胞数量的比值)。方法:分别培养SD乳鼠的成骨细胞与SD大鼠的BMSCs,将成骨细胞和BMSCs以1∶9、2∶8、3∶7、1∶0的不同比例进行混合培养,通过测定第3、6、9天培养液上清中的碱性磷酸酶(ALP)的含量,研究成骨细胞促BMSCs有效成骨的最小比值。将两种细胞以该最小浓度比混匀接种于涂附I型胶原壳聚糖材料支架上(直径9 mm,高3mm)作为混合培养组,相同终浓度的单纯成骨细胞和单纯BMSCs分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照。另设置低比值成骨细胞对照组(仅含有共培养组中相同的成骨细胞数,但不含有共培养组中的BMSCs)。全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生骨进行评价。结果:成骨细胞和BMSCs以3∶7的比例进行混合培养时已可实现有效成骨。3∶7比例的混合培养组及阳性对照组(成骨细胞组)体外培养8周后大体观察和苏木素-伊红染色(HE)、ALP染色基本相同,均表达骨特异性细胞外基质I型胶原,形成了较成熟的骨组织。阴性对照组(单纯BMSCs组)和低比值成骨细胞组,原细胞支架复合物变小、变形。低比值成骨细胞组在局部形成了少量的骨组织,阴性对照组(单纯BMSCs组)未能发现骨样组织形成。结论:在不使用细胞因子或化学药物的情况下,成骨细胞提供的成骨微环境能够在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化并形成成熟的骨组织。混合细胞中成骨细胞与BMSCs的比例为3∶7时是有效成骨的最小比值。
- 刘宁查振刚王双利林宏生王国普
- 关键词：骨髓基质细胞成骨细胞骨形成
- 组织工程化骨软骨复合体的构建
- 2007年
- 传统的治疗关节骨软骨损伤的方法包括自体、同种异体骨软骨柱移植、软骨清除，甚至关节假体置换等，在取得一定成功的同时，也出现了诸如供区继发性受损、免疫排斥、疾病传播及金属假体松动等不足，并且长期疗效不理想。组织工程技术的出现与发展为该类问题的解决提供了一个新途径。现就我们的理解并结合文献，对组织工程化骨软骨复合体的构建的有关方面做一综述。
- 王双利查振刚
- 关键词：骨软骨损伤组织工程化同种异体骨假体置换免疫排斥假体松动
