王克振
- 作品数：6 被引量：7H指数：2
- 供职机构：暨南大学生命科学技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省科技攻关计划广东省粤港关键领域重点突破项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学轻工技术与工程更多>>
- 奶牛乳腺特异性多位点基因打靶载体构建
- 引言动物乳腺生物反应器可以用来生产人类所需要的生物活性产品或药物,因此有广泛的应用前景。动物乳腺生物反应器的外源基因表达易受位置效应影响,因为随机整合的外源基因通常是优先插入到转录活跃的基因位点上,从而破坏细胞生命活动的...
- 欧阳宏佳王克振唐冬生聂庆华张细权
- 文献传递
- 利用锌指核酸酶的高效多位点基因打靶研究
- 基因打靶技术已经越来越受到研究工作者的青睐,该技术也逐渐走向成熟。但是,传统的基因打靶所依赖的同源重组仅仅是个10~(-6)-10~(-5)之间的低概率事件。近几年以来,本课题组已经建立起了以基因组中度重复序列rDNA的...
- 王克振
- 关键词：基因打靶锌指核酸酶同源重组
- 文献传递
- 人工锌指核酸酶的设计与表达纯化
- 2008年
- 设计表达了4个锌指核酸酶,用于切断人基因组中的rRNA基因家族的内部转录间隔序列,造成双链断裂,以此提高针对多位点基因打靶的效率,为后续基因打靶应用于基因治疗研究奠定基础。首先,在人rRNA基因家族ITS1序列中找到2个合适的9 bp长的序列(中间间隔6bp)为锌指蛋白识别位点,根据识别位点序列每个位点分别设计2个三锌指蛋白。通过设计引物进行重叠延伸PCR得到全长编码锌指蛋白的DNA,分别克隆到表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET28a-ZFP,转化大肠杆菌RossettaTM(DE3),实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与纯化。同时,将限制性内切酶FokI的切割结构域分别与4个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆到表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET28a-ZFN,转化到大肠杆菌RossettaTM(DE3),实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。
- 蒋泓曾芳王克振梁沂梅李月琴张细权周天鸿唐冬生
- 关键词：锌指核酸酶生物合成纯化基因打靶基因治疗
- 多位点基因打靶介导的高效基因治疗技术研究
- 该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因细胞或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokI的切割结构域连接...
- 唐冬生蒋泓刘芳王克振张勇曾芳梁沂梅邓廷贤欧阳宏佳
- 关键词：基因治疗锌指核酸酶基因打靶
- 锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶被引量：4
- 2012年
- 该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.
- 唐冬生蒋泓刘芳王克振张勇曾芳梁沂梅邓廷贤欧阳宏佳李月琴张细权周天鸿
- 关键词：锌指核酸酶基因打靶同源重组转基因动物基因治疗
- 多位点基因打靶的定点整合效率研究被引量：3
- 2009年
- 利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1。通过脂质体将其转染至HEK293细胞内。通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率。试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术。
- 王克振蒋泓唐冬生曾芳梁沂梅李月琴周天鸿
- 关键词：基因打靶HEK293细胞
