高鹤
- 作品数：11 被引量：43H指数：3
- 供职机构：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划中国疾病预防控制中心青年科研基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用被引量：16
- 2011年
- 目的摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义。方法通过融合PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株。结果成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株。结论通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能。
- 刘霞高鹤杨琳张义全谭亚芳郭兆彪黄新祥杨瑞馥周冬生
- 关键词：同源重组
- 调控子fur影响霍乱弧菌生物膜的形成(英文)被引量：2
- 2013年
- 目的:铁摄取调节蛋白Fur,其在细菌体内维持铁代谢稳态中担任着抑制剂和激活剂的双重角色,已有研究证实Fur还是霍乱弧菌的毒力调控子。研究证实生物膜的形成和游动性与霍乱弧菌的毒力相关,因此我们通过一系列表型实验分析Fur蛋白对霍乱弧菌生物膜形成影响,并预测依赖Fur与霍乱弧菌致病相关的基因,为后续研究做准备。方法:基于自杀质粒缺失霍乱弧菌的Fur基因,并构建相应回补株及蛋白表达株;通过表型实验,比较霍乱弧菌野生株和fur突变株在细菌运动能力、生物膜形成。结果:成功构建霍乱弧菌fur缺失株,回补株和蛋白表达株,His-Fur蛋白在上清液表达。表型实验表明fur突变株的菌株游动性降低,生物膜形成能力增强。结论:因此我们得出Fur可能与其它调控子一起,调控霍乱弧菌的表多糖,TCP和鞭毛蛋白的合成,从而抑制霍乱弧菌生物膜的合成。转录调控子Fur直接或间接调控一些与环境生存和致病相关的基因,对霍乱弧菌的传播、侵染、定殖等过程发挥作用奠定了基础。
- 陈秀琴蔡红艳张卫闫梅英高鹤段国贤闫志勇
- 关键词：霍乱弧菌FUR生物膜形成
- CalR激活副溶血弧菌Ⅵ型分泌系统1相关基因的转录被引量：1
- 2022年
- 【目的】研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对calR基因以及CalR对VI型分泌系统1 (type Ⅵ secretion system 1,T6SS1;vp1386-1420)相关基因的转录调控关系。【方法】提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株的总RNA,采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)研究调控子对靶基因的转录调控关系;采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断调控子对靶基因的调控关系;将靶基因的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和调控子基因突变株中,获得LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验进一步研究调控子对靶基因的调控关系。PCR扩增靶基因的上游调控区DNA序列,并纯化His-重组调控子蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)研究His-重组蛋白对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作用,若有结合作用,则进一步采用DNase I足迹实验研究具体的结合位点。【结果】在细菌生长密度(OD600)从0.05依次增加到1.20时,CalR的表达水平呈梯度升高特征;QS系统在低细胞密度下的核心调控子AphA对calR基因的转录没有调控作用,而高细胞密度下的核心调控子OpaR对calR基因的转录具有间接的激活作用。此外,在非诱导条件下,CalR直接结合到vp1388-1390、vp1393-1406、vp1400-1406和vp1409-1407启动子区DNA序列上促进它们的转录。【结论】OpaR间接激活CalR的表达,而CalR是非诱导条件下维持T6SS1基础表达所必需的调控子。
- 陆仁飞李雪薛星帆张苗苗孙君芳高鹤周冬生张义全
- 关键词：副溶血弧菌
- 副溶血弧菌在乳鼠肠道内竞争性定殖实验方法的建立及应用
- 2015年
- 目的建立评价副溶血弧菌在乳鼠肠道内定殖能力的实验方法,为研究副溶血弧菌的致病机制奠定基础。方法构建带有霍乱弧菌lac Z基因的副溶血弧菌临床分离株RIMD2210633(WT)的Lac Z菌株(WT-lac Z);比较WT菌株与WT-lac Z菌株以及WT-lac Z菌株与环境分离株VP1907在CD-1乳鼠(5日龄)肠道定殖能力的差别。结果成功构建X-Gal LB平板上显蓝色的副溶血弧菌Lac Z菌株。WT-lac Z菌株和WT菌株在乳鼠肠道内定殖能力无差别,这表明可以用WT-lac Z菌株代替WT菌株进行后续的实验;VP1907与WT-lac Z菌株在乳鼠肠道内定殖的竞争系数在0.1左右,表明WT菌株的定殖能力明显高于VP1907菌株。结论建立了评价副溶血弧菌肠道定殖能力的乳鼠模型,并应用该模型进行了临床分离株与环境分离株肠道定殖能力的比较分析。
- 王维刚李杰赵宏群阚飙高鹤
- 关键词：副溶血弧菌乳鼠
- 不同生长时期鼠疫耶尔森菌调控子Fis转录谱的比较分析
- 2011年
- 目的:进行不同生长时期鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)野生株和fis突变株转录谱的比较分析。方法:基于Red重组系统缺失替换鼠疫菌的fis基因;用鼠疫菌全基因组DNA芯片转录谱技术,比较不同生长时期鼠疫菌野生株和fis突变株在转录水平上的差异;用实时定量RT-PCR对转录谱结果进行验证。结果:构建了鼠疫菌fis::Km突变株,芯片杂交数据与RT-PCR验证的比较结果表明二者有较高的相关性,相关系数r=0.93。结论:无论生长对数期还是稳定期,Fis都能够激活或抑制鼠疫菌一些重要基因的转录,如Ⅲ型分泌系统效应蛋白编码基因、psaAB、pla、rovA等,表明Fis可能与其他调控子一起,在鼠疫菌的代谢及毒力因子转录的协调控制上起关键作用。
- 马立芝高鹤张义全谭亚芳郭兆彪杨瑞馥周冬生
- 关键词：鼠疫耶尔森氏菌
- Hfq对霍乱弧菌环境适应能力的影响及相关基因的转录调控被引量：2
- 2013年
- 目的通过表型实验分析Hfq蛋白对霍乱弧菌环境适应能力的影响，并通过分子实验验证Hfq对环境生存及致病相关基因转录的调控。方法基于自杀质粒缺失霍乱弧菌的hfq基因，并构建相应回补株；通过表型实验，比较霍乱弧菌野生株和hfq突变株在细菌运动能力、生物膜形成、外膜抗性和氧化应激能力上的差异；应用逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR）技术对Hfq可能调控的相关基因的转录水平进行比较。结果成功构建霍乱弧菌hfq缺失株及回补株，表型实验表明hfq突变株的菌株游动性降低，生物膜形成能力增强，对十二烷基磺酸钠（SDS）和庆大霉素的耐受性显著下降，并且与野生株相比，hfq突变株对H2O2刺激更为敏感。RT-qPCR实验证明Hfq对霍乱弧菌鞭毛合成、胞外多糖合成、外膜蛋白以及氧化应激相关基因的转录有调控作用。结论Hfq蛋白作为RNA伴侣分子，能够通过调控一些生存及致病相关基因的转录进而影响霍乱弧菌的生物膜形成、氧化应激反应、抗生素抗性等能力，表明Hfq可能与其他调控子一起，在霍乱弧菌的生存、代谢以及致病因子转录的协调控制上起关键作用。
- 陈秀琴闫志勇李杰王瑞白闫梅英阚飙高鹤
- 关键词：霍乱弧菌HFQ环境适应转录调控
- 鼠疫菌、副溶血性弧菌及肺炎克雷伯菌CRP蛋白的表达及其DNA结合活性分析被引量：3
- 2011年
- 目的表达有活性的鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)、副溶血性弧菌以及肺炎克雷伯菌的cAMP受体蛋白(CRP)并进行DNA体外结合活性分析,为深入研究3种CRP蛋白间的交互转录调控作用奠定基础。方法应用大肠埃希菌pET系统体外表达鼠疫菌201株、副溶血性弧菌5421株以及肺炎克雷伯菌tw518株的CRP蛋白;应用生物信息学对3种CRP蛋白进行同源性比较,并对CRP与靶DNA的结合基序(CRP consensus)进行分析预测;通过体外凝胶阻滞实验(EMSA)和DNaseⅠ足迹实验验证His?CRP与DNA的结合活性。结果成功表达出3种菌有活性的His?CRP融合蛋白,3种CRP蛋白对鼠疫菌pla、副溶血性弧菌toxR及肺炎克雷伯菌kfuA基因均有结合活性。结论 3种CRP蛋白都能直接结合到鼠疫菌pla、副溶血性弧菌toxR及肺炎克雷伯菌kfuA基因的启动子区,说明上述3种CRP蛋白对3种病原菌的重要毒力基因的转录可能具有交互调控作用。
- 杨琳高鹤张义全刘霞谭亚芳郭兆彪黄新祥杨瑞馥周冬生
- 关键词：鼠疫菌副溶血性弧菌肺炎克雷伯菌
- 我国施万菌分布及其分子特征分析
- 2023年
- 目的探索中国施万菌的种群分布、分子流行病学特征及遗传进化关系,为施万菌的流行病学监测和进化研究提供依据。方法利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)联合gyrB基因测序进行施万菌种水平鉴定;利用7个管家基因(16SrRNA、gyrA、gyrB、infB、recN、rpoA和topA)进行多位点序列分型(MLST),利用BioNumerics7.1软件对各个序列类型(ST)构建最小生成树。结果本研究共收集全国201株施万菌,鉴定到10个不同的菌种,其中海藻施万菌所占数量最多。不同分离来源中的施万菌种分布有所差异,临床和食品来源的施万菌种分布相似。MLST将施万菌实验室分离株划分成136个ST型和15个克隆复合体(CCs),其中CC12为海藻施万菌优势克隆群。结论我国分布的施万菌病原谱丰富多样,提示这些菌株具有高度的遗传多样性。
- 黄振洲于可艺汪永禄李颖高鹤白雪梅肖悦赖玖连李坤王多春
- 关键词：种群分布分子分型
- 鼠疫菌重要调控子蛋白的表达纯化及DNA结合活性分析被引量：2
- 2011年
- 目的:利用大肠杆菌BL21(λDE3)的表达系统,表达7个有活性的、与鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)传播及致病密切相关的调控子蛋白,并对这些蛋白与DNA的结合活性进行分析,为构建鼠疫菌毒力基因转录调控网络建立分子生化实验平台。方法:通过分子克隆技术构建鼠疫菌调控子蛋白的表达菌株,所得菌株经IPTG诱导后能分别表达鼠疫菌CRP、Fur、PhoP、OxyR、OmpR、RcsB和RovA带His标签的融合蛋白;对这些蛋白与DNA的结合基序进行生物信息学预测;通过体外凝胶迁移实验验证上述蛋白与靶DNA的结合活性。结果:表达了7种有活性的鼠疫菌调控子蛋白,这些蛋白与靶基因启动子区具有体外结合活性。结论:表达的7种调控子蛋白在鼠疫菌的传播致病中有重要作用,这些调控子蛋白与DNA体外结合实验平台的建立,是构建鼠疫菌毒力基因转录调控网络的基础。
- 罗张高鹤张义全王丽谭亚芳郭兆彪杨瑞馥周冬生
- 关键词：鼠疫耶尔森菌调控蛋白DNA结合活性
- 鼠疫菌H-NS蛋白的表达与纯化及其DNA结合活性分析被引量：19
- 2011年
- 【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3的表达系统,表达出有活性的鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)调控子蛋白H-NS,为进一步研究H-NS的转录调控奠定基础。【方法】PCR扩增鼠疫菌201株hns基因的编码区,将其直接克隆入pET28a质粒中,再将pET28a-hns重组质粒转入大肠杆菌BL21λDE3菌株中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出鼠疫菌His-H-NS蛋白;通过体外的凝胶迁移实验(EMSA)和DNaseⅠ足迹实验对His-H-NS蛋白与DNA的结合活性进行分析。【结果】成功表达出有活性的鼠疫菌His-H-NS蛋白,该蛋白对鼠疫菌pH6抗原基因(psaA、psaE)及rovA基因均有结合活性。【结论】鼠疫菌His-H-NS具有DNA结合活性,说明H-NS能调控鼠疫菌基因的转录。
- 张义全高鹤王丽罗张谭亚芳郭兆彪杨瑞馥周冬生
- 关键词：鼠疫耶尔森氏菌H-NSDNA结合活性
