刘宝芹
- 作品数：9 被引量：54H指数：5
- 供职机构：中国水产科学研究院珠江水产研究所更多>>
- 发文基金：公益性行业(农业)科研专项国家现代农业产业技术体系建设项目引进国际先进农业科技计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 草鱼呼肠孤病毒HZ08株S4基因序列分析被引量：4
- 2012年
- 草鱼呼肠孤病毒HZ08株是本实验室从患出血病草鱼体内分离到的一个新毒株,已完成部分基因序列的分析,其氨基酸序列的同源性和873株相比,仅为20%～30%之间。因序列差异较大,无法通过设计特异性引物来扩增和分析其基因序列,采用单引物扩增技术,对HZ08株S4基因进行序列分析表明:S4全长为2263 bp,最大的ORF编码717个氨基酸,推导出其表达的蛋白约为79 kDa。正如其他基因节段,基因末端也含有保守碱基序列5'(GUAAUUU…UUCAUC),3'。S4基因推导的氨基酸序列与同宿主的其他呼肠孤病毒的非结构蛋白NS1同源性最大,其次是和哺乳动物正呼肠孤病毒的非结构蛋白mu-NS以及禽呼肠孤病毒非结构蛋白NS1同源性较大,表明S4可能表达细胞骨架相关蛋白。基于S4推导出的氨基酸序列构建的系统进化树HZ08株单独作为一个分支,与同宿主的其他呼肠孤病毒亲缘关系比较近,而与其他呼肠孤病毒则相对较远。这提示HZ08株可能是多个毒株的遗传信息经长期的遗传进化而得,综合其它已知序列信息,推测HZ08株可能为呼肠孤病毒的一个新成员。
- 曾伟伟王庆张超张乐生刘宝芹刘永奎石存斌吴淑勤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒遗传进化树
- 草鱼呼肠孤病毒JX-0901株FQ-PCR检测方法的建立及其在定量分析中的应用被引量：5
- 2012年
- 根据GCRV JX-0901株S7基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了针对GCRV JX-0901株病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并利用FQ-PCR方法对该毒株在不同鱼类细胞中的增殖情况和不同温度条件下的稳定性进行了定量分析。结果显示,建立的FQ-PCR方法的Ct值与标准品在1.0×101～1.0×108拷贝/μL浓度范围呈良好的线性关系,R2高达0.999;该方法有较好的敏感性和特异性,最低模板检出量为10个拷贝,只能特异地检测出GCRV JX-0901,不能检出其他鱼类常见病毒。该毒株能在10种常见鱼类细胞中增殖,其中在L8824细胞中的增殖量最大,含量达到4.1933×107拷贝/μL;此外,该毒株对温度敏感性较弱,病毒在48、56℃条件下放置96 h后才失去对CIK细胞感染性,而在4、15、28、37℃条件下放置32d,-20℃条件下储存2年仍具有较高的含量和较强的感染性。
- 刘宝芹曾伟伟王庆张乐生王英英石存斌李华吴淑勤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒FQ-PCR
- 草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用被引量：26
- 2013年
- 针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析。结果表明,Ⅰ型阳性率为9.3%,Ⅱ型阳性率为45.3%,Ⅲ型阳性率为2.3%,Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%,Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%,其他类型的混合感染未检测到。表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。本研究建立的GCRV三重PCR检测方法可以特异性的检测各种类型的草鱼呼肠孤病毒,且具有较高的敏感性;利用该方法进行草鱼出血病初步的流行病学分析表明,目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型,不同毒株类型混合感染的现象也普遍存在。本方法的建立旨在对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查提供实用的可操作手段。
- 曾伟伟王庆王英英张乐生刘宝芹石存斌吴淑勤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒草鱼出血病三重PCR基因型流行病学调查
- 草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用被引量：13
- 2012年
- 草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。
- 刘宝芹曾伟伟王庆张乐生王英英石存斌吴淑勤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒FQ-PCR
- 一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析被引量：32
- 2011年
- 从江西南昌患出血病草鱼体内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09-01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量病毒聚集,形态和排列方式与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)相似。针对GCRV 873株S6基因设计的简并引物可以从病料组织和感染细胞中扩增出目的条带,而针对GCRV HZ08株S6基因设计特异性引物未能扩增出目的条带。对JX09-01株的S6全基因进行序列分析表明,其核苷酸序列同GCRV 873株和HZ08株的同源性分别是99.3%和30.4%,推导出的氨基酸序列同源性分别是98.6%和30%,说明草鱼病毒JX09-01株为草鱼呼肠孤病毒。用JX09-01株接种当年8—10 cm左右的草鱼,没有明显的临床症状,不能致草鱼死亡。用传代至15代的CIK细胞病毒液进行免疫保护试验,结果显示其对强毒株的免疫保护率达到86.7%。实验结果初步显示,新分离到的JX09-01为草鱼呼肠孤病毒弱毒株,可作为弱毒疫苗的候选毒株。
- 曾伟伟王庆刘永奎张乐生刘宝芹石存斌吴淑勤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒免疫原性
- 草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白多克隆抗体的制备及其特性分析
- 目的：表达草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株VP4蛋白及制备VP4蛋白高效价多克隆抗体并对其特性进行初步分析。方法：采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株s6基因(表达VP4蛋白)部分节段，经BamHI和Xho I...
- 曾伟伟王庆刘宝芹刘永奎石存斌吴淑勤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒蛋白基因多克隆抗体
- 草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：7
- 2011年
- 目的原核表达、纯化草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)HZ08株VP4蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用PCR法扩增GCRV HZ08株S6基因部分节段,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a-S6,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定其效价,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为51 000,表达量占菌体总蛋白的73%,主要以包涵体形式表达,反应原性良好;制备的多克隆抗体效价约为1∶8 000,且具有较高的特异性。结论成功制备了GCRV HZ08株VP4蛋白高效价多克隆抗体,为VP4蛋白功能的深入研究、抗原表位分析、草鱼出血病诊断方法的建立及相关基因工程疫苗的研发奠定了基础。
- 曾伟伟王庆张乐生刘宝芹刘永奎石存斌曾令兵吴淑勤
- 关键词：呼肠孤病毒草鱼多克隆抗体
- 草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法的建立及其初步应用
- 由草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病给我国淡水鱼养殖造成了巨大的经济损失。变异迅速和复杂的病原学是导致其流行的主要原因,根据已发表的全基因组或部分节段基因序列信息,总体上可以将草鱼呼肠孤病毒分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个类型。本研究针对...
- 曾伟伟王庆王英英张乐生刘宝芹石存斌吴淑勤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒三重PCR基因型分子流行病学
- 文献传递
- 草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用
- 草鱼出血病是危害我国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒（Grass carp hemorrhage Virus,GCRV）,其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的...
- 刘宝芹曾伟伟王庆吴淑勤张乐生王英英石存斌
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒FQ-PCR
- 文献传递
