葛亚俊
- 作品数：4 被引量：11H指数：2
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- 人VIGILIN参与调控肝癌细胞H19和IGF2印记基因表达的研究被引量：2
- 2009年
- 目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的调控。方法通过流式细胞术检测人肝癌细胞HepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检测各周期点VIGILIN、H19、IGF2基因表达。结果①HepG2细胞周期约为20h;其中0～9h、20～28h约为S期,9～20h、28～39h约为G2/M、G1期,并选定6h、20h、43h、60h,分别代表S期中期、G1～S期、S期中期和G1期末;②细胞周期同步化后加入血清,刺激VIGILIN转录,上调VIGILIN的表达,从G2/M至G1期,逐渐增加,G1期末达高峰,S期逐渐减少;与之相反,H19的表达,在S期逐渐增加,在G2/MG1期逐渐减少,在S期中期达到高峰。而IGF2的表达也增加但没有明显的周期性。H19与VIGILIN mRNA表达呈负相关(r=-0.6941,P<0.05)。③用VIGILIN shRNA(pSIREN-VIG shRNA)重组载体转染HepG2细胞48h后,相对于3个对照组(未转染组,脂质体转染组和转染pSIREN-GFP shRNA组),实验组VIGILIN mRNA的表达受到明显抑制,此时,IGF2mRNA表达增加30.13%,H19mRNA表达减少12.08%。结论VIGILIN和H19 mRNA表达与细胞周期有关;VIGILIN参与调控H19、IGF2印记基因的表达。
- 葛亚俊谢晓砚杨博柴新娟张迎春覃扬
- 关键词：MRNA表达细胞周期
- 中药成分CDP对乳腺癌细胞P16,E-CADHERIN去甲基化作用的研究被引量：6
- 2009年
- 目的探讨中药成分CDP对乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435的抑癌基因P16和E-CADHERIN启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435,分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytidine(5-aza-C)处理细胞;用甲基化特异性PCR(MSP)和半定量RT-PCR,检测细胞中P16和E-CADHERIN基因的甲基化改变和RNA表达恢复情况。结果①在25、50、75和100μmol/L剂量的CDP持续作用6d后,T47D细胞P16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带减弱,在100μmol/L剂量时消失,在4个剂量CDP作用下,非甲基化特异性条带均重新出现;在75和100μmol/L浓度作用下时,T47D细胞中出现P16基因重新表达;②在50μmol/LCDP作用144h后,T47DP16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍存在;非甲基化特异性条带24h出现并持续到144h;在药物作用144h时,P16出现表达。③在MDA-MB-435细胞中,用不同剂量CDP处理或同一剂量CDP处理不同时间后,均未观察到E-CADHERIN非甲基化条带的出现,RT-PCR也未检测到E-CADHERIN基因的表达。结论在T47D细胞中,中药成分CDP可以剂量、时间依赖的形式逆转高甲基化的P16基因,而对MDA-MB-435细胞中高甲基化的E-CADHERIN基因无效,提示CDP药物存在靶分子反应多样性。
- 柴新娟栾菊杨文理张迎春葛亚俊覃扬
- 关键词：P16E-CADHERIN去甲基化T47D
- 人VIGILIN的shRNA真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞周期影响的初探被引量：2
- 2008年
- 目的构建靶向人高密度脂蛋白结合蛋白(VIGILIN)的shRNA真核表达载体,并初步探索VIGILIN与人肝癌细胞系HepG2细胞周期是否有关联。方法构建人VIGILIN的shRNA重组质粒,并将重组质粒pSIREN-VIG转染HepG2细胞,采用RT-PCR和Western-blot检测HepG2细胞VIGILIN mRNA和蛋白的表达,并用流式细胞术检测细胞周期是否有所改变。结果1HepG2细胞转染pSIREN-VIG后,VIGILIN的表达被特异、有效地抑制。转染48h后,VIGILIN的表达从mRNA和蛋白的水平都有明显的减少;2VIGILIN表达抑制后,G2/M期细胞所占比例增加:相对于三个对照组(未转染组2.4%,脂质体转染组4.9%和转染pSIREN-GFP组6.5%),实验组(转染pSIREN-VIG组)G2/M期细胞增加到9.4%。结论我们成功的构建了能特异、有效的抑制人VIGILIN表达的shRNA表达质粒,人VIGILIN能够影响到细胞周期的正常运行,导致G2/M期阻滞。
- 谢晓砚魏玲杨文理葛亚俊覃扬
- 关键词：RNA干扰细胞周期
- 人CTCF N端融合蛋白的表达、抗体制备及鉴定被引量：1
- 2010年
- 为研究CTCF的功能,进一步探索肿瘤的发病机制,我们成功制备了人转录因子CTCF N端融合蛋白多克隆抗体,并初步用于肿瘤细胞CTCF表达状态的分析。采用已构建的表达质粒PGEX-4T-2-CTCF-N,经IPTG诱导表达GST-CTCF N融合蛋白,亲和层析纯化GST-CTCF N融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。并通过Western blot,对肿瘤细胞和组织CTCF蛋白表达状态进行初步分析。本实验成功在大肠杆菌BL21中诱导表达了GST-CTCF N融合蛋白,经亲和层析纯化获得了纯化的融合蛋白。免疫新西兰大白兔获得了较高生物活性和特异性的多克隆抗体,Western blot证实此多克隆抗体能够特异性识别HepG2、HeLa、MCF-7癌细胞及组织的内源性CTCF蛋白,为今后从蛋白质水平研究CTCF基因表达调控研究打下了基础。
- 张迎春蒋磊魏玲柴新娟葛亚俊覃扬
- 关键词：CTCF多克隆抗体WESTERNBLOT肿瘤细胞表达
