王露
- 作品数：8 被引量：22H指数：3
- 供职机构：蚌埠医学院更多>>
- 发文基金：安徽省高校省级自然科学研究项目安徽省蚌埠市科技计划项目蚌埠市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人凋亡相关因子基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装被引量：1
- 2015年
- 目的:构建人凋亡相关因子(Fas)基因短发夹RNA慢病毒载体,实现沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达。方法:根据Fas基因mRNA序列,设计4组靶向Fas基因的短发夹RNA序列,合成、退火形成双链DNA片段,与经过DNA内切酶Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞,对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及比对分析。通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。结果:经酶切及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,通过荧光显微镜观察证明病毒转入293T细胞,感染效率>90%,并获得高滴度的慢病毒载体,病毒滴度为3×108TU/ml。结论:成功构建人Fas基因RNA干扰慢病毒载体,为下一步转染脐带间充质干细胞提供理论参考。
- 王露李见翟玮玮李玉云
- 关键词：RNA干扰慢病毒载体293T细胞
- 骨髓间充质干细胞与再生障碍性贫血的研究进展被引量：5
- 2012年
- 再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）是一种由造血干细胞缺陷、造血微环境损伤及免疫异常引起的骨髓造血功能衰竭以及外周全血细胞减少的综合征[1]。AA的发病机制尚未完全明确,其发病机制可能和造血干细胞的内在缺陷、造血微环境的异常以及机体免疫功能紊乱有关,
- 管英华谢杨虎魏晓巍李见王露李玉云
- 关键词：间充质干细胞再生障碍性贫血造血微环境
- IDO基因重组慢病毒载体构建及其转染hUCMSCs细胞的实验研究
- 2013年
- 目的构建共同表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体,探讨其在人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)中的表达,为下一步利用高表达IDO的hUCMSCs移植治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法将IDO基因克隆至慢病毒pGC-FU-EGFP表达载体中,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。重组慢病毒表达载体质粒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;制备携带IDO基因的慢病毒Lentivirus-IDO,并测定重组慢病毒的滴度。用重组慢病毒以最佳MOI值感染hUCM-SCs作为实验组,以空载体转染的hUCMSCs(空载体组)及未转染的hUCMSCs(未转染组)作为对照,应用RT-PCR及Western blot法分别检测细胞中IDO mRNA及IDO蛋白水平的表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定pGC-FU-EGFP-IDO重组慢病毒表达载体构建成功,包装慢病毒Lentivirus-IDO滴度为2×108 TU/mL。通过EGFP表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为30,此时对细胞的转染效率可达到80%以上。RT-PCR检测显示实验组IDO mRNA表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性;Western blot检测示实验组细胞内IDO蛋白表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性。结论成功构建了人IDO基因的重组慢病毒表达载体,慢病毒Lentivirus-IDO能有效感染hUCMSCs,IDO蛋白可在hUCMSCs中长期、稳定表达。
- 李玉云李见王露翟玮玮吴正中张强
- 关键词：再生障碍性贫血人脐带间充质干细胞绿色荧光蛋白慢病毒载体
- 人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血小鼠造血的影响被引量：1
- 2013年
- 目的:通过从脐带中分离和培养脐带间充质干细胞(MSCs),探讨其对再生障碍性贫血(再障)小鼠骨髓造血的影响。方法:原代贴壁法培养人脐带MSCs,将小鼠分为模型组、对照组、MSCs输注组进行实验。经静脉输注免疫介导方法建立再障模型小鼠,分别于3、7、14、21、28 d观察其外周血象指标变化和骨髓组织形态;ELISA检测造血负调控因子(IFN-γ)的水平,计数骨髓造血干细胞集落生成单位。结果:原代培养中脐带组织块直接贴壁后8～10 d,边缘爬出长梭形MSCs,随传代培养呈平行、漩涡状生长;再障小鼠经MSCs输注治疗后外周血象明显增高,IFN-γ水平下降(P<0.01);治疗组骨髓红细胞集落形成单位与粒-巨噬细胞集落形成单位均较模型组明显增高(P<0.01),成纤维细胞集落形成单位计数差异无统计学意义(P>0.05)。结论:人脐带来源的MSCs对再障模型小鼠骨髓可发挥造血支持作用。
- 管英华魏晓巍谢扬虎李见王露李玉云张强
- 关键词：再生障碍性贫血间充质干细胞脐带
- 慢病毒介导RNA干扰沉默Fas基因在脐带间充质干细胞中的表达被引量：10
- 2014年
- 目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体,建立Fas基因稳定干扰的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)株,为下一步使用低表达Fas基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法以人Fas基因mRNA序列作为干扰靶点,设计4组靶向Fas的shRNA序列,合成寡核苷酸,与经过BamHI、EcoRI双酶切后的LV3载体连接获得重组慢病毒,通过感染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养人UC-MSCs,使用包装好的慢病毒感染UCMSCs,应用Real time-PCR和Western blotting检测感染后细胞中Fas mRNA及蛋白的表达情况。结果经酶切以及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,病毒悬液滴度为3×108TU/ml。Real time-PCR和Western blotting结果显示干扰组细胞的Fas表达水平较对照组显著降低。结论慢病毒介导的SiRNA能有效沉默UC-MSCs中Fas基因的表达。
- 王露翟玮玮杨向荣王芳李见张强李玉云
- 关键词：慢病毒SIRNAFAS脐带间充质干细胞
- 三七总皂苷抑制K562细胞mTOR信号通路活性的实验研究被引量：3
- 2015年
- 目的探讨三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对体外培养K562细胞m TOR信号通路相关分子表达及活性的影响。方法不同浓度的PNS（50~800μg/m L）干预体外培养K562细胞24~72 h后,MTT比色法检测PNS对K562细胞增殖的抑制作用;AO/EB双荧光染色法观察细胞死亡及凋亡状况;RT-PCR检测m TOR、p70S6K、4E-BP1 mRNA表达变化;Western blot检测m TOR、p70S6K、4E-BP1及p-m TOR、p-p70S6K、p-4E-BP1蛋白表达量的变化。结果与对照组相比,浓度为100~800μg/m L的PNS能够抑制K562细胞增殖（P〈0.05）,促进K562细胞凋亡及死亡（P〈0.05）,PNS对K562细胞72 h的IC50为（229.07±2.36）μg/m L;100、200、400μg/m L PNS作用于K562细胞72 h后m TOR蛋白表达量及mRNA表达量降低（P〈0.05）,且磷酸化蛋白p-m TOR（Ser2448）、p-p70S6K（Thr229/389）及p-4E-BP1（Thr37/46）表达水平也随着药物浓度的增加而降低（P〈0.05）。结论 PNS能够抑制K562细胞m TOR信号通路的活性,这可能是PNS抑制K562细胞增殖的机制之一。
- 翟玮玮李玉云杨向荣于北凯王露李见
- 关键词：三七总皂苷K562细胞M
- 重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定
- 2014年
- 目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;采用Wester blot检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。
- 李见王露李玉云
- 关键词：基因表达慢病毒载体293T细胞
- 脐血间充质干细胞表达的IDO对异基因淋巴细胞的增殖及再生障碍性贫血小鼠造血恢复的影响被引量：2
- 2013年
- 目的探讨脐带血间充质干细胞(UCB-MSCs)发挥免疫调节作用机制及对再生障碍性贫血小鼠的治疗效应。方法采集足月胎儿脐带血,采用羟乙基淀粉沉降+淋巴细胞分离两步法分离培养UCB-MSCs。观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物,成骨、成脂诱导鉴定分化潜能。研究UCB-MSCs表达吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)的情况。建立UCB-MSCs与异基因淋巴细胞共培养体系,探讨其发挥免疫调节作用的机制;同时构建免疫介导再生障碍性贫血小鼠模型,观察其对再障造血恢复的影响。结果 UCB-MSCs为成纤维样细胞,贴壁生长。流式细胞仪检测结果表明,其不表达造血标志CD34,高表达CD44、CD73,体外成功诱导成骨与成脂分化。经γ干扰素(IFN-γ)诱导表达IDO活性,对异基因淋巴细胞的增殖可能发挥免疫抑制作用。MSCs输注再生障碍性贫血小鼠模型,可减轻小鼠骨髓造血衰竭程度。结论 UCB-MSCs在体外成功分离培养,并具有间充质干细胞生物学特性;MSCs可能通过IDO途径发挥免疫负调控作用。UCB-MSCs的IDO表达对于免疫介导再障小鼠模型的骨髓造血恢复具有改善作用。
- 李玉云魏晓巍李见王露张英杰张强
- 关键词：间充质干细胞异基因免疫介导
