刘钊
- 作品数：14 被引量：43H指数：4
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金重庆市医学科研计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 人内源性博尔纳样核蛋白-1的原核表达及纯化
- 2014年
- 目的原核表达人内源性博尔纳样核蛋白-1(endogenous Borna-like N element-1,EBLN-1),并进行纯化及鉴定。方法以人工合成的EBLN-1基因为模板,PCR扩增EBLN-1基因,克隆至载体pET-41a中,构建重组表达质粒pET-41aEBLN-1,转化大肠埃希菌BL21(DE3)和Rosetta中,分别于18℃和37℃下进行IPTG诱导表达。采用包涵体稀释复性法对表达蛋白进行复性,经His亲和层析纯化后,SDS-GAGE和Western blot法鉴定纯化产物。结果重组表达质粒pET-41a-EBLN-1经菌落PCR及测序鉴定构建正确。重组表达蛋白相对分子质量约48 000,以包涵体形式表达。在大肠埃希菌Rosetta中37℃诱导时表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上,纯化后蛋白纯度可达90%,可与HRP标记的His探针特异性结合。结论成功表达并纯化了重组EBLN-1蛋白,为后续深入研究EBLN-1在人体中的生理作用及其与精神疾病的相关性奠定了基础。
- 吴迪金戈刘钊张亮黄荣忠杨德雨谢鹏
- 关键词：原核细胞基因表达纯化
- 氢化可的松联合rmIL-2、rmIL-15体外扩增小鼠NK细胞
- 2015年
- 目的建立氢化可的松联合rmIL-2、rmIL-15体外扩增小鼠NK细胞的方法 ,观察该培养方法对扩增后NK细胞的纯度、扩增效率及功能的影响。方法应用免疫磁珠分选法(MACS)分离得到高纯度的小鼠脾脏CD3-CD49b+NK细胞,依据添加刺激因子的不同将纯化后的NK细胞分成A组(rmIL-2)、B组(rmIL-2+rmIL-15)和C组(氢化可的松+rmIL-2+rmIL-15)进行体外培养,每3日添加新鲜培养基及细胞刺激因子。采用台盼蓝拒染法进行活细胞计数;流式细胞术检测CD3-CD49b+NK细胞纯度;CFSE稀释法检测NK细胞的增殖效率;MTT比色法检测NK细胞杀伤活性;流式细胞术检测NK细胞膜表面CD107a的表达。结果磁珠分选后NK细胞纯度由分选前的(8.59±1.41)%提高为分选后的(91.60±1.33)%。体外扩增培养15 d后A组扩增的NK细胞纯度降低[(75.02±3.48)%,P<0.01],B组(85.87±4.79)%和C组(88.04±3.35)%与扩增前相比较无明显差异(P>0.05)。扩增15 d后C组NK细胞扩增倍数为(45.06±1.64)倍,显著高于A组(5.28±0.34,P<0.01)和B组(25.39±3.29,P<0.05)。细胞增殖实验结果表明培养第7天和第14天各组NK细胞增殖指数(PI)分别为A组(2.26±0.81)和(3.27±1.21),B组(4.62±1.45)和(15.82±3.92),C组(6.91±1.34)和(23.66±5.42)。培养第7天和第14天NK细胞增殖指数C组>B组>A组(P<0.05)。当效靶比为10∶1时,C组扩增后NK细胞肿瘤杀伤率为(81.27±2.32)%,显著高于A组[(37.20±7.32)%,P<0.01]和B组[(69.51±6.32)%,P<0.05]扩增后NK细胞。C组(49.32±4.36)%扩增后NK细胞CD107a表达水平显著高于A组[(9.37±1.82)%,P<0.001]和B组[(28.46±4.21)%,P<0.01)]NK细胞。结论氢化可的松联合rmIL-2+rmIL-15培养方案能够有效地体外扩增并活化小鼠NK细胞,为NK细胞的肿瘤过继免疫治疗应用于临床奠定了实验基础。
- 高祥黄婧刘钊骆晨罗诗樵
- 关键词：NK细胞
- 体外扩增自体CD4^+CD25^+调节性T细胞促进小鼠供体来源肿瘤的转移被引量：1
- 2014年
- 目的研究输注体外扩增自体CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)治疗是否存在增加供体来源肿瘤转移的风险。方法取Balb/c(H-2d)小鼠骨髓细胞,在重组鼠源性GM-CSF和IL-4诱导以及TNF-α刺激下分化为成熟树突状细胞。免疫磁珠法(MACS)从Balb/c(H-2d)小鼠脾脏分选出CD4+CD25+Tregs,加入成熟树突状细胞和高浓度重组鼠源性IL-2,体外扩增7 d。流式细胞术检测新鲜以及扩增后CD4+CD25+Tregs纯度及免疫抑制功能。将Balb/c(H-2d)小鼠随机分为2组,实验组:经尾静脉注射1×107体外扩增后CD4+CD25+Tregs,24 h后注射5×105 B16-F10(H-2b)(鼠源性黑色素瘤细胞);对照组:单独输注5×105 B16-F10(H-2b)。结果新鲜分选和扩增后CD4+CD25+Tregs纯度及免疫抑制功能无明显下降。对照组肺部肿瘤结节为(9±8)个,实验组肺部肿瘤结节为(118±15)个。与对照组相比,实验组肺部肿瘤结节明显增加(P<0.01)。结论体外扩增的CD4+CD25+Tregs具有抑制机体抗肿瘤能力,过继输注体外扩增的自体CD4+CD25+Tregs治疗移植后排斥反应,能够增加供体来源肿瘤转移的风险。
- 刘钊罗诗樵郭涛高祥
- 关键词：调节性T细胞成熟树突状细胞
- 原发性肝癌自发性破裂出血的相关危险因素分析被引量：6
- 2014年
- 目的探讨原发性肝癌自发性破裂出血的相关危险因素。方法将2006年1月至2012年12月重庆医科大学附属第一医院收治的原发性肝癌自发性破裂出血的56例患者纳入研究组,另选择同期住院肝癌未发生破裂的56例患者纳入对照组。比较两组患者一般情况、实验室检查结果、影像学检查结果等资料。结果对照组与研究组在有无门静脉癌栓、肿瘤突出肝脏表面是否大于1cm,以及甲胎蛋白、凝血酶原时间、纤维蛋白原(FIB)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)水平等方面比较差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析显示肿瘤突出肝脏表面大于1cm,以及FIB、HBeAg水平为原发性肝癌自发性破裂出血的独立危险因素。结论肿瘤突出肝脏表面大于1cm,以及FIB、HBeAg水平是原发性肝癌自发性破裂出血的独立危险因素。
- 戴珏刘钊高翔李泽朝周勇罗诗樵
- 关键词：肝癌破裂出血
- 抗博尔纳病病毒磷蛋白多克隆抗体的制备及鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的制备抗博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)重组磷蛋白(p24)多克隆抗体,并对其进行鉴定,为BDV血清免疫学检测方法的建立奠定基础。方法用本课题组前期制备的重组BDVp24蛋白经背腿部多点皮下注射免疫新西兰大白兔,共免疫4次,末次免疫后第7天采血,分离血清,采用抗原亲和纯化法纯化抗血清,ELISA法测定抗血清效价;Western blot和免疫荧光鉴定其特异性。结果制备的抗BDV p24多克隆抗体的纯度为98%,ELISA效价达1∶128 000,该抗体与重组p24蛋白和BDV感染OL细胞表达的p24蛋白均能发生特异性反应。结论成功制备了灵敏性和特异性良好的抗BDV p24多克隆抗体,为研发相关的诊断试剂和研究该病毒的感染发病机制奠定了基础。
- 马丽华黄荣忠张亮徐晓艳曾粒刘钊邓婧李文娟谢鹏
- 关键词：博尔纳病病毒磷蛋白类多克隆抗体
- 比较体外扩增调节性T细胞的两种方法
- 2015年
- 利用免疫磁珠法(immunomagnetic beads,MACS)从BALB/c小鼠脾脏中分别分离出CD4+CD25+Tregs(regulatory T cells)和CD4+T细胞,CD4+CD25+Tregs加入anti-CD3/CD28磁珠与1 000 U/m L IL-2体外扩增14 d;CD4+T细胞加入anti-CD3/CD28磁珠、100 U/m L IL-2和5 ng/m L重组人源性转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)体外扩增5 d。分析两种方法扩增后Tregs免疫抑制功能及数量。结果显示,两种方法扩增的Tregs免疫抑制功能无明显差别(P>0.05),但是分别从大小相当的BALB/c小鼠脾脏所提取出的细胞中,通过CD4+T细胞扩增5 d可以得到(4.9±0.4)×107 Tregs,而通过CD4+CD25+Tregs扩增14 d只能得到(1.9±0.1)×107 Tregs(P<0.05)。结果发现,通过两种方法扩增得到的Tregs免疫抑制功能无明显差异,但是通过CD4+T细胞扩增Tregs方法所需时间短,而且得到的细胞数量多。
- 刘钊罗诗樵
- 关键词：调节性T细胞扩增免疫抑制功能
- 外周血浆血清和中枢脑区杏仁核的蛋白质组学研究
- 第一部分：基于PEG分级联合免疫亲和层析的外周血浆蛋白质组研究 研究背景： 由于血浆成分复杂且蛋白浓度差异较大，血浆蛋白质组学研究难度较大，特别是基于质谱的血浆低丰度蛋白生物标志物研究面临巨大挑战。传统的单一分级方式...
- 刘钊
- 关键词：蛋白质组学杏仁核突触可塑性
- 输注体外扩增的同源CD4^+CD25^+调节性T细胞增进小鼠肿瘤易感性被引量：3
- 2014年
- 目的研究过继输注体外扩增同源调节性T细胞(Treg)对小鼠抗肿瘤免疫的影响,探索过继输注Treg治疗方法可能存在的风险。方法免疫磁珠分离法分离小鼠脾脏内CD4+CD25+Treg,流式细胞术测定其纯度后予以CD3/CD28单克隆抗体磁珠和大剂量IL-2(1 000 U/mL)刺激,进行2周2轮次扩增后收集Treg,混合淋巴细胞培养测定其体外抑制功能;后将1×107Treg静脉注射BALB/c小鼠,24 h后再注射B16F10肿瘤细胞,同时设置单独接种肿瘤细胞组,14 d后计数肺部移植瘤数目,测定外周血Treg比例。结果新鲜CD4+CD25+Treg纯度大于95%,平均96.3%±2.88%,体外扩增后纯度大于85%,平均87.73%±2.35%;与新鲜Treg相比,扩增后抑制功能未受损(P>0.05);给BALB/c小鼠注射1×106B16F10细胞后14 d肺部肿瘤结节数为(14±5)个,先注射1×107体外扩增Treg后再注射1×106B16F10细胞,肿瘤结节数增多为(73±9)个(P=0.007),与单独注射2×106B16F10细胞相当(86±8)个(P=0.230);给C57BL/6小鼠输注5×105B16F10细胞后结节数为(70±15)个,预先输入8×106体外扩增Treg后再注射5×105B16F10细胞,肺部肿瘤结节数明显增多,大于300个,与前者相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时荷瘤小鼠外周血Foxp3+Treg比例上升更为显著(P<0.05)。结论过继输注体外扩增Treg诱导移植物免疫耐受的同时,可能抑制机体的抗肿瘤免疫,因此存在一定风险。
- 郭涛罗诗樵许继凡戴珏刘钊高祥
- 关键词：肿瘤免疫FOXP3移植免疫
- 输注体外扩增同源CD4+CD25+Treg细胞增进小鼠肿瘤易感性
- 目的研究过继输注体外扩增同源调节性T细胞对小鼠抗肿瘤免疫的影响,探索过继输注Treg治疗方法可能存在的风险。方法免疫磁珠分离法(MACS)分离小鼠脾脏内CD4~+CD25~+调节性T细胞(regulatory T cel...
- 郭涛罗诗樵刘钊
- 基于聚乙二醇和乙醇两步非变性沉淀法的人血清白蛋白组分析
- 研究背景： 人血清白蛋白是一种带负电荷的可溶性蛋白质，约占血清总蛋白的50％。白蛋白可与一些外源性和内源性因子相结合，起运输作用。在血清蛋白质组学研究中，一般首先要去除白蛋白等高丰度蛋白，进而发现低丰度蛋白中潜在的疾病...
- 刘钊
- 关键词：聚乙二醇乙醇血清检测
